第六章光学检测技术-张静ppt课件

1、第六章第六章 光学检测技术光学检测技术 利用物质所具有的各种光学性质，对物质利用物质所具有的各种光学性质，对物质进行定性、定量及结构分析的技术。进行定性、定量及结构分析的技术。 包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检包括：旋光检测、荧光检测、分光光度检测、散射光谱检测等。测、散射光谱检测等。 生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、生化领域常用：分光光度检测、旋光检测、荧光检测荧光检测第一节第一节 旋光检测技术旋光检测技术 利用旋光计测量出旋光物质光学活性物质对利用旋光计测量出旋光物质光学活性物质对偏振光旋转角度的方向左旋或右旋和大小，偏振光旋转角度的方向左旋或右旋和大小，从而进行定性与定量分析的

2、技术，称为旋光检测从而进行定性与定量分析的技术，称为旋光检测技术。技术。 旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物旋光物质对偏振光的旋转方向和角度大小是该物质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋质的固有特性。偏振光旋转的方向和角度称为旋光度。左旋（），右旋（）。光度。左旋（），右旋（）。 物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外物质的旋光度主要取决于物质本身的结构，此外与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与与入射光的波长及温度有关，对溶液而言，还与溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。溶液性质、溶液浓度和溶液厚度有密切关系。 旋光法：应用旋光仪测量旋光性物质的旋旋光法：应用旋光仪

3、测量旋光性物质的旋光度以确定其含量的分析方法。光度以确定其含量的分析方法。 旋光度和比旋光度是旋光性物质的主要物理性质。旋光度和比旋光度是旋光性物质的主要物理性质。通过旋光度和比旋光度的测定，可以检查光学活性化通过旋光度和比旋光度的测定，可以检查光学活性化合物的纯度，也可以定量分析有关化合物溶液的浓度。合物的纯度，也可以定量分析有关化合物溶液的浓度。 光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向互相垂直。光是一种电磁波，即光波的振动方向与其前进方向互相垂直。自然光有无数个与光的前进方向互相垂直的光波振动面。若光线前自然光有无数个与光的前进方向互相垂直的光波振动面。若光线前进的方向指向我们，则与

4、之互相垂直的光波振动平面可表示为如图进的方向指向我们，则与之互相垂直的光波振动平面可表示为如图a），图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，），图中箭头表示光波振动的方向。若使自然光通过尼科尔棱镜，由于振动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，由于振动面与尼科尔棱镜的光轴平行的光波才能通过尼科尔棱镜，所以通过尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向互相垂直的光所以通过尼科尔棱镜的光，只有一个与光的前进方向互相垂直的光波振动面，如图波振动面，如图b）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。）。这种仅在一个平面上振动的光叫偏振光。自然光与偏振光自然光与偏振光 通常用以下两种方

5、法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。通常用以下两种方法产生偏振光：尼科尔棱镜或偏振片。尼科尔棱镜尼科尔棱镜 一块方解石的菱形六面体末端的表面磨光，使镜角一块方解石的菱形六面体末端的表面磨光，使镜角等于等于68，将之对角切成两半，把切面磨成光学平面后，再用，将之对角切成两半，把切面磨成光学平面后，再用加拿大树胶粘起来，便成为一个尼科尔棱镜。其中非常光线加拿大树胶粘起来，便成为一个尼科尔棱镜。其中非常光线MP由方解石到加拿大树胶是由光疏介质到光密介质，必将发由方解石到加拿大树胶是由光疏介质到光密介质，必将发生折射通过加拿大树胶，由棱镜的另一端面射出，从而产生了生折射通过加拿大树胶，由棱镜的另一端面射

6、出，从而产生了平面偏振光。平面偏振光。偏振光的产生偏振光的产生尼科尔棱镜示意图尼科尔棱镜示意图偏振片偏振片 利用偏振片也能产生偏振光。它是利利用偏振片也能产生偏振光。它是利用某些双折射晶体如电气石的二色性，即用某些双折射晶体如电气石的二色性，即可选择性吸收寻常光线，而让非常光线通过的可选择性吸收寻常光线，而让非常光线通过的特性，把自然光变成偏振光。特性，把自然光变成偏振光。 分子结构中有不对称碳原子，能把偏振光的偏分子结构中有不对称碳原子，能把偏振光的偏振面旋转一定角度的物质称为光学活性物质。振面旋转一定角度的物质称为光学活性物质。许多食品成分都具有光学活性，如单糖、低许多食品成分都具有光学活

7、性，如单糖、低聚糖、淀粉以及大多数的氨基酸和羟酸等。聚糖、淀粉以及大多数的氨基酸和羟酸等。其中能把偏振光的振动平面向右旋转的，称其中能把偏振光的振动平面向右旋转的，称为为“具有右旋性具有右旋性”，以十号表示；反，以十号表示；反之称为之称为“具有左旋性具有左旋性”，以一号表示。，以一号表示。旋光性、旋光性物质旋光性、旋光性物质旋光度旋光度 偏振光通过光学活性物质的溶液时，其振偏振光通过光学活性物质的溶液时，其振动平面所旋转的角度叫做该物质溶液的旋光度，动平面所旋转的角度叫做该物质溶液的旋光度，以以表示。旋光度的大小与光源的波长、温度、表示。旋光度的大小与光源的波长、温度、旋光性物质的种类、溶液的

8、浓度及液层的厚度旋光性物质的种类、溶液的浓度及液层的厚度有关。对于特定的光学活性物质，在光源波长有关。对于特定的光学活性物质，在光源波长和温度一定的情况下，其旋光度和温度一定的情况下，其旋光度与溶液的浓与溶液的浓度度c和液层的厚度和液层的厚度L成正比。成正比。 即：即：KcL比旋光度比旋光度 当旋光性物质的浓度为当旋光性物质的浓度为 100 g/100 ml，液层，液层厚度为厚度为 l dm分米时所测得的旋光度称为比分米时所测得的旋光度称为比旋光度，以旋光度，以 表示表示 。由上式可知：。由上式可知： K11K 即：即： 式中：式中： 比旋光度，度；比旋光度，度； t 温度，温度， 光源波长，

9、光源波长，nm； 旋光度，度；旋光度，度； L液层厚度或旋光管长度，液层厚度或旋光管长度，dm； c溶液浓度，溶液浓度，gml。LC t t t 比旋光度与光的波长及测定温度有关。通常比旋光度与光的波长及测定温度有关。通常规定用钠光规定用钠光D D线波长线波长 589.3nm 589.3nm在在2020时测定，时测定，在此条件下，比旋光度用在此条件下，比旋光度用 表示表示 因在一定条件下比旋光度因在一定条件下比旋光度 是已知的，是已知的，L为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光为一定，故测得了旋光度就可计算出旋光质溶液中的浓度质溶液中的浓度c。 20D t变旋作用变旋作用定义定义 具有光学活性的

10、还原糖类如葡萄糖，具有光学活性的还原糖类如葡萄糖，果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其果糖，乳糖、麦芽糖等），在溶解之后，其旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，旋光度起初迅速变化，然后渐渐变得较缓慢，最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用。最后达到恒定值，这种现象称为变旋作用。 这是由于有的糖存在两种异构体，即这是由于有的糖存在两种异构体，即型和型和型，型，它们的比旋光度不同。这两种环型结构及中间的开链它们的比旋光度不同。这两种环型结构及中间的开链结构在构成一个平衡体系过程中，即显示出变旋光作结构在构成一个平衡体系过程中，即显示出变旋光作用。用。 变旋现象变旋现象 因此，在用旋光法测定蜂蜜

11、，商品葡萄糖等含有还原糖的因此，在用旋光法测定蜂蜜，商品葡萄糖等含有还原糖的样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需立即测定，样品时，样品配成溶液后，宜放置过夜再测定。若需立即测定，可将中性溶液可将中性溶液pH=7加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定加热至沸，或加几滴氨水后再稀释定容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚容；若溶液已经稀释定容，则可加入碳酸钠干粉至石蕊试纸刚显碱性。在碱性溶液中，变旋光作用迅速，很快达到平衡。但显碱性。在碱性溶液中，变旋光作用迅速，很快达到平衡。但微碱性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破坏样品。微碱性溶液不宜放置过久，温度也不可太高，以免破

12、坏样品。旋光仪旋光仪WXG型半荫旋光仪型半荫旋光仪检糖计检糖计WZB自动旋光仪自动旋光仪WGX型半荫旋光仪型半荫旋光仪结构和原理结构和原理 起偏棱镜一般用尼科尔起偏棱镜一般用尼科尔Nicol)棱镜，以获得偏振光。棱镜，以获得偏振光。 旋光管盛装待测液的玻璃管。旋光管盛装待测液的玻璃管。 检偏棱镜仍用尼科尔检偏棱镜仍用尼科尔Nicol)棱镜，用以检测从旋光管射出的偏棱镜，用以检测从旋光管射出的偏振光振动平面与原来相比较的角度振光振动平面与原来相比较的角度可由刻度盘上的数值读出）。可由刻度盘上的数值读出）。检糖计检糖计 检糖计专用于糖类的测定。检糖计专用于糖类的测定。故刻度数值直接表示为蔗糖的故刻

13、度数值直接表示为蔗糖的百分含量百分含量W/V），其测定原），其测定原理与旋光计相同。在结构上有理与旋光计相同。在结构上有以下特点以下特点 检糖计的基本光学元件检糖计的基本光学元件自动旋光仪自动旋光仪当检测池中放进存有被测溶液的试管后，当检测池中放进存有被测溶液的试管后，由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转由于溶液具有旋光性，使平面偏振光旋转了一个角度，零度视场便发生了变化，转了一个角度，零度视场便发生了变化，转动检偏镜一定角度，能再次出现亮度一致动检偏镜一定角度，能再次出现亮度一致的视场。这个转角就是溶液的旋光度，测的视场。这个转角就是溶液的旋光度，测得溶液的旋光度后，就可以求出物质的比得溶液

14、的旋光度后，就可以求出物质的比旋度。根据比旋度的大小，就能确定该物旋度。根据比旋度的大小，就能确定该物质的纯度和含量了。质的纯度和含量了。 旋光法测定味精浓度旋光法测定味精浓度 样品溶液配制样品溶液配制 精确称取味精样品精确称取味精样品10.00g，加，加4050mL蒸馏水蒸馏水溶解，搅拌加入分析纯盐酸溶解，搅拌加入分析纯盐酸16mL，使味精全部，使味精全部溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至溶解。冷却至室温，蒸馏水定容至100mL。 旋光仪调零旋光仪调零 预热预热10min，放进滤光片。取，放进滤光片。取16mL分析纯盐酸分析纯盐酸蒸馏水定容至蒸馏水定容至100mL。装满旋光管，调整零点。装满旋光

15、管，调整零点。 样品液测定样品液测定 样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，样品洗涤旋光管三次，装满旋光管，放进样品室，测定旋光度，记录温度。测定旋光度，记录温度。 物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能物质被辐射能照射后，分子内部获得外源能量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变量，基态分子能级的电子跃迁到较高能级，转变成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状成激发态分子能级，使分子处在高能域不稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态，因此，它必须释放多余的能量，变成稳定状态的分子。态的分子。 分子发光：由激发态能级回到基态能级的过程分子发光：由激发态能级回到基态能级的过

16、程中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波中以光的形式释放多余的能量，并发射出比原波长更长的光谱。长更长的光谱。 荧光分光光度法：检测分子发射光谱的分析方荧光分光光度法：检测分子发射光谱的分析方法。法。第二节第二节 荧光检测技术荧光检测技术一、特点一、特点 专一性强专一性强灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸灵敏度高：测定同样浓度物质的含量，通常比吸收光谱灵敏度高收光谱灵敏度高24个数量级左右。个数量级左右。选择性强：既可分析发射光谱，也可分析激发光选择性强：既可分析发射光谱，也可分析激发光谱，偏振光谱。谱，偏振光谱。发光方式多：物理发光，化学发光，生物发光。发光方式多：物理发光，化学

17、发光，生物发光。可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧可分析参数多：可分析荧光光谱，荧光强度，荧光效率，荧光寿命等多种物理参数。光效率，荧光寿命等多种物理参数。 二、方法原理二、方法原理荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的荧光现象：是一种发光现象，当一种波长的光照射在某一荧光物质时，该物质被激发光照射在某一荧光物质时，该物质被激发, 若若能在极短的时间内发射出较激发波长更长波能在极短的时间内发射出较激发波长更长波长的光长的光, 在激发态停留的时间大约在激发态停留的时间大约10-810-4s. 发射的光谱称为荧光光谱发射的光谱称为荧光光谱.磷光光谱磷光光谱: 若这种光在激发态停留较长的时若

18、这种光在激发态停留较长的时间间, 即在激发态停留的时间大约是即在激发态停留的时间大约是10-410s, 系统内发射出比荧光波长更长波长的光系统内发射出比荧光波长更长波长的光. 发射发射的光谱称为磷光光谱的光谱称为磷光光谱.荧光产生机理荧光产生机理（1分子能级：最低第一级电分子能级：最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的子激发态振动能级是产生荧光的基础。分子吸收能量后，电子跃基础。分子吸收能量后，电子跃迁到哪一个能级并不重要，重要迁到哪一个能级并不重要，重要的是吸收了能量的分子经过内转的是吸收了能量的分子经过内转移以后，将能量降到最低第一级移以后，将能量降到最低第一级电子激发态振动能级后，能否

19、以电子激发态振动能级后，能否以光子的形式释放能量，如能就会光子的形式释放能量，如能就会发射荧光，否则不会。发射荧光，否则不会。（2耗能方式耗能方式:产生荧光产生荧光:分子内在因素和外在条件决定分子内在因素和外在条件决定.在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量在同一能级中分子间的相互碰撞消耗能量;无辐射衰减转给周围分子变成振动能消耗无辐射衰减转给周围分子变成振动能消耗;辐射荧光辐射荧光-以光子的形式释放能量以光子的形式释放能量;光分解消耗分子内部的能量光分解消耗分子内部的能量(光分解以产生热光分解以产生热的方式，使物质结构发生变化，发光基的方式，使物质结构发生变化，发光基团的发光能量减弱或丧失团的

20、发光能量减弱或丧失). （3能量的传递途径能量的传递途径: 处于较高能级的激发处于较高能级的激发态电子回到基态途径态电子回到基态途径当两个电子能级非常靠近当两个电子能级非常靠近以致其振动能级发生重叠以致其振动能级发生重叠时，电子由高能级以无辐时，电子由高能级以无辐射跃迁方式转移给低能级射跃迁方式转移给低能级不同多重态间的无辐射跃迁，不同多重态间的无辐射跃迁，如如S1T1。有时通过热激发，。有时通过热激发，就有可能发生就有可能发生T1 S1 ，然，然后产生延迟荧光后产生延迟荧光被激发分子与溶剂分子或其他被激发分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用把多余的溶质分子的相互作用把多余的能量转移给周围分

21、子，使荧光能量转移给周围分子，使荧光或磷光发射的强度减弱或消失。或磷光发射的强度减弱或消失。也称荧光熄灭或猝灭也称荧光熄灭或猝灭激发态分子把多余的振动激发态分子把多余的振动能量以热的形式转给周围能量以热的形式转给周围分子，而自身从分子，而自身从Sn的较高的较高振动能级层降低到该电子振动能级层降低到该电子能级的最低振动能级层上能级的最低振动能级层上处于第一激发单重态最低处于第一激发单重态最低振动能级的电子回到基态振动能级的电子回到基态振动能级时，在短时间内振动能级时，在短时间内发射一个光子返回到基态发射一个光子返回到基态分子的系间窜跃跃迁后，分子的系间窜跃跃迁后，就会发生快速的振动弛豫就会发生快

22、速的振动弛豫到达第三激发单重态最低到达第三激发单重态最低振动能级上，以光子的形振动能级上，以光子的形式跃迁回到基态式跃迁回到基态（4分子荧光的类型分子荧光的类型: 根据荧光物质所需的根据荧光物质所需的激发光源不同和吸能后发射荧光光谱的差激发光源不同和吸能后发射荧光光谱的差异异, 分为分为:物理发光物理发光(物理物理/光致荧光）：荧光分子吸收光致荧光）：荧光分子吸收了光能了光能(如以如以X射线，紫外光，激光等为光射线，紫外光，激光等为光源的辐射能等源的辐射能等)而产生的荧光而产生的荧光; 化学发光化学发光: 通过分子与分子之间的化学反应通过分子与分子之间的化学反应所产生的化学能，在化学反应过程中

23、释放所产生的化学能，在化学反应过程中释放能量而发射荧光能量而发射荧光; 生物发光生物发光: 通过生物体内的荧光酶与荧光物通过生物体内的荧光酶与荧光物质相互作用，在生物化学反应过程中所释质相互作用，在生物化学反应过程中所释放出来的光能放出来的光能. 2. 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物的分子在吸收任何荧光化合物的分子在吸收能量和释放能量的过程中，都存在能量和释放能量的过程中，都存在着激发光谱和发射光谱。着激发光谱和发射光谱。激发光谱：荧光分子首先要从外界得激发光谱：荧光分子首先要从外界得到相应的能量，才能具备发光的基到相应的能量，才能具备发光的基本条件本条件,才有可能发射荧

24、光。才有可能发射荧光。 在选择最佳激发波长时，可通在选择最佳激发波长时，可通过测量分子的激发光谱来确定。过测量分子的激发光谱来确定。p发射光谱：发射光谱： 分子发射荧光的特征波长比吸分子发射荧光的特征波长比吸收的特征波长长。收的特征波长长。 p 发射光谱的形状与激发光谱极为相发射光谱的形状与激发光谱极为相似似,且呈镜像对称关系。且呈镜像对称关系。3. 荧光量子产率与分子结构荧光量子产率与分子结构（1荧光分子产生荧光的条件：荧光分子产生荧光的条件：荧光分子必须具有与所照射的辐射频荧光分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，能吸收激发光提率相适应的结构，能吸收激发光提供的辐射能；供的辐射能；分

25、子吸收了与本身特征频率相同能量分子吸收了与本身特征频率相同能量后，必须具有产生一定的荧光量子后，必须具有产生一定的荧光量子的能力。的能力。 产生荧光量子的强弱可用荧光产生荧光量子的强弱可用荧光量子产率也称荧光效率或量子效量子产率也称荧光效率或量子效率来表示：率来表示：（2分子结构与荧光的关系：分子结构与荧光的关系：共轭效应：含有共轭效应：含有-*电子跃迁能级化合物的电子跃迁能级化合物的荧光最强。荧光最强。 绝大多数能发射荧光的化合物，都是绝大多数能发射荧光的化合物，都是芳香族或杂环类化合物或者在它们的分子芳香族或杂环类化合物或者在它们的分子中含有芳香族或杂环类基团。中含有芳香族或杂环类基团。

26、苯类化合物的对苯基化、间苯基化及苯类化合物的对苯基化、间苯基化及乙烯化作用能够增强苯分子的荧光强度。乙烯化作用能够增强苯分子的荧光强度。p分子的刚性平面结构：能产生较强荧光。分子的刚性平面结构：能产生较强荧光。这种结构可以减少分子的振动，分子与溶这种结构可以减少分子的振动，分子与溶剂或其他溶质分子相互之间的作用降低了，剂或其他溶质分子相互之间的作用降低了，这样更有利于荧光的发射如芴和联二苯这样更有利于荧光的发射如芴和联二苯的荧光效率分别为的荧光效率分别为1.0和和0.2；荧光素有很强；荧光素有很强的荧光，而酚酞没有荧光）。的荧光，而酚酞没有荧光）。p取代效应：给电子基团如取代效应：给电子基团如

27、-OH，-OR，-NH2，p -CN，-NR等能使荧光增强，得电子基团等能使荧光增强，得电子基团如如-COOH，-C=O，-NO2，-NO及卤素离子等及卤素离子等能使荧光减弱能使荧光减弱三、仪器的结构与原理三、仪器的结构与原理1. 荧光分光光度法定量分析基本原理荧光分光光度法定量分析基本原理 溶液的荧光强度和该溶液吸收光能的程度以溶液的荧光强度和该溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。及溶液中荧光物质的荧光量子效率有关。2. 荧光分光光度计的结构荧光分光光度计的结构 激发光源激发光源,激发单色器激发单色器,样品池样品池,发射单色发射单色器器,检测器及显示系统检测器及显示系统激

28、发光源：要求能发出强度较大，连续稳定激发光源：要求能发出强度较大，连续稳定的光源。的光源。 理论上理论上,发射荧光的强度取决于激发光发射荧光的强度取决于激发光源的强度源的强度. 实际应用中选择光源的强度不实际应用中选择光源的强度不能太强也不能太弱。能太强也不能太弱。 要根据荧光物质的性质选择合适光源要根据荧光物质的性质选择合适光源:对光敏感或发射荧光较强的物质选用较弱对光敏感或发射荧光较强的物质选用较弱光源光源,反之可选较强光源反之可选较强光源. 测量荧光强度仪器：滤光片荧光分光光度计测量荧光强度仪器：滤光片荧光分光光度计和结构复杂的精密荧光分光光度计。主要部件：和结构复杂的精密荧光分光光度计

29、。主要部件：激发光源激发光源: 前者常用汞灯前者常用汞灯, 后者常用氙灯后者常用氙灯(250700 nm).滤光片和单色器：前者采用两个滤光片滤光片和单色器：前者采用两个滤光片(激发滤光激发滤光片片/荧光滤光片荧光滤光片)；后者采用光栅作单色器。；后者采用光栅作单色器。样品池：低荧光的玻璃或石英制成，形状以散射光样品池：低荧光的玻璃或石英制成，形状以散射光较少的方形为宜。较少的方形为宜。检测器：阻挡层光电池检测器：阻挡层光电池(500600 nm最灵敏最灵敏)，缺陷：，缺陷：易疲劳，灵敏度低；光电倍增管检测器：灵敏度易疲劳，灵敏度低；光电倍增管检测器：灵敏度高，使用简单，特别适用于强度微弱光的

30、测量。高，使用简单，特别适用于强度微弱光的测量。四、实验技术影响荧光分析的因素）四、实验技术影响荧光分析的因素） v 溶液的溶液的pH的影响：在溶液中，绝大多数的影响：在溶液中，绝大多数荧光物质都是以离子状态形式存在的，荧光物质都是以离子状态形式存在的，发射荧光的最佳条件是解离的荧光分子。发射荧光的最佳条件是解离的荧光分子。 v 温度的影响温度的影响: 温度升高，荧光物质产生的温度升高，荧光物质产生的荧光效率和荧光强度都会下降，反之。荧光效率和荧光强度都会下降，反之。v 溶剂的影响：荧光物质的荧光波峰位置溶剂的影响：荧光物质的荧光波峰位置和荧光强度与溶剂的介电常数有关。和荧光强度与溶剂的介电常

31、数有关。 v 不同溶剂对各种荧光物质发生荧光的不同溶剂对各种荧光物质发生荧光的影响程度是不同的，某些溶剂可使荧光影响程度是不同的，某些溶剂可使荧光物质形成配合物，某些溶剂可改变荧光物质形成配合物，某些溶剂可改变荧光物质的解离状态。物质的解离状态。v 激发光源的影响：光分解激发光源的影响：光分解:荧光化合物被强荧光化合物被强激发光照射会发生分解，引起荧光强度迅速激发光照射会发生分解，引起荧光强度迅速下降。所以，荧光分光光度计通常在激发光下降。所以，荧光分光光度计通常在激发光单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸单色器后装配有光闸，在测定时才打开光闸让激发光照射样品池。让激发光照射样品池。v 器皿

32、污染的影响：器皿内壁含极少量荧光物器皿污染的影响：器皿内壁含极少量荧光物质，会使测定结果造成偏差，最好用质，会使测定结果造成偏差，最好用30%硝硝酸清洗酸清洗 。v 内滤效应的影响：在样品溶液中存在着杂质内滤效应的影响：在样品溶液中存在着杂质或测试样品池浓度太大引起荧光变弱的现象。或测试样品池浓度太大引起荧光变弱的现象。v 自吸收：样品浓度大，荧光分子吸收光能和自吸收：样品浓度大，荧光分子吸收光能和发射荧光的同时有部分重叠，而引起可检测发射荧光的同时有部分重叠，而引起可检测的荧光强度变弱。的荧光强度变弱。v 杂质吸收：样品溶液中存在能吸收激发光或杂质吸收：样品溶液中存在能吸收激发光或发射光能量

33、的杂质，使检测到的光强度变弱。发射光能量的杂质，使检测到的光强度变弱。 稀样品溶液的影响稀样品溶液的影响: 氧化作用：荧光物质的稀溶液不如浓度氧化作用：荧光物质的稀溶液不如浓度高的溶液稳定，易发生氧化作用高的溶液稳定，易发生氧化作用(肾上腺肾上腺素，素，1 g/mL，100 g/mL) 光分解：稀溶液相对于高浓度溶液更易光分解：稀溶液相对于高浓度溶液更易发生光分解，尤其对光较敏感的物质。发生光分解，尤其对光较敏感的物质。 表面吸附：某些非待测的荧光物质吸附表面吸附：某些非待测的荧光物质吸附在比色皿内壁表面上，在分析过程中这在比色皿内壁表面上，在分析过程中这些荧光物质发射相应的荧光，干扰测定。些

34、荧光物质发射相应的荧光，干扰测定。对稀溶液影响大。另外，表面吸附对不对稀溶液影响大。另外，表面吸附对不同溶剂吸附程度不同，有机溶剂表面吸同溶剂吸附程度不同，有机溶剂表面吸附更明显。附更明显。 五、荧光检测技术的应用五、荧光检测技术的应用 根据发光机理，能吸收能量后以光子的形式释放能量的化合物都属根据发光机理，能吸收能量后以光子的形式释放能量的化合物都属荧光物质。荧光物质。发光方式分：发光方式分：自荧光物质自荧光物质(分子中含荧光发光基团或化学键分子中含荧光发光基团或化学键)外源荧光物质外源荧光物质(要与某些荧光物质或荧光燃料以共价键或离子键的形式结合要与某些荧光物质或荧光燃料以共价键或离子键的

35、形式结合) 分析方法分析方法:1、 定量分析方法：定量分析方法： （1标准曲线法标准曲线法 （2外标法直接比较法）：在一定浓度范围内，外标法直接比较法）：在一定浓度范围内，选择一个合适的标准样品浓度，将其在荧光分光选择一个合适的标准样品浓度，将其在荧光分光光度计上测得的值与在同样条件下的未知样品的光度计上测得的值与在同样条件下的未知样品的值进行比较，得出未知样品的浓度。值进行比较，得出未知样品的浓度。未知样品浓度未知样品浓度mg/mL）=(A1/A2)c 式中，式中，A1为未知样品的荧光发光值，为未知样品的荧光发光值，A2为标为标准样品的荧光发光值，准样品的荧光发光值，c为标准样品浓度。为标准

36、样品浓度。2、定性分析：根据荧光发射的波长和出现的峰位，、定性分析：根据荧光发射的波长和出现的峰位，确定物质结构的某些特征确定物质结构的某些特征. 第三节第三节 分光光度检测技术分光光度检测技术a a、目视比色法、目视比色法 用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方用眼睛比较溶液颜色的深浅以确定物质浓度的方法称为目视比色法。法称为目视比色法。特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不特点：设备简单、操作简便；无需单色光；准确度不高。高。b b、分光光度计、分光光度计 基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。而建立起来的分析

37、方法。包括：包括：分光光度检测技术分光光度检测技术（Chapter two spectrophotography) 定义: 分光光度检测技术是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术。 特点: 灵敏、准确、快速和简便，在复杂组分系统中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。 运用: 生物化学研究中广泛使用的方法之一，广泛用于糖，蛋白质，核酸，酶等的快速定量检测。分光光度检测的分类分光光度检测的分类分光光度检测的分类分光光度检测的分类红外分光光度检测红外分光光度检测: 可见光分光光度检测可见光分光光度检测: 紫外分光光度检测紫外分光光度检测:测定波长范围为大于测定波长范

38、围为大于760 760 nmnm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400760 400760 nmnm的可见光区的可见光区 测定波长范围为测定波长范围为200200400 400 nmnm的紫外光区的紫外光区 一、分光光度计工作原理一、分光光度计工作原理 包括波长范围为包括波长范围为400760 nm的可见光区和波长范的可见光区和波长范围为围为200400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的紫外光区。不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。源。 钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的钨灯的发射光谱：钨灯光

39、源所发出的400760nm波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、波长的光谱，光通过三棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为可见光分光光度计的光源。可见光分光光度计的光源。 氢灯的发射光谱：氢灯能发出氢灯的发射光谱：氢灯能发出185400 nm波长的波长的光谱，可作为紫外光分光度计的光源。光谱，可作为紫外光分光度计的光源。 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收

40、光谱。 不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据溶液的吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质。 用不同波长的单色光照射，测定吸光度，如果以用不同波长的单色光照射，测定吸光度，如果以波长波长 为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为横坐标，吸光度为纵坐标即可得一条曲线称为吸收曲线（为吸收曲线（ A曲线）。曲线）。吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。吸收曲线清楚地描述了物质对光的吸收情况。 吸收曲线吸收曲线00.10.20.30.40.50.6400450500550600650波长（波长（nm）A max=510 nm （1不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同。不同物质吸收曲线的形状和吸收波长不同

41、。MnO4-531吸收曲线吸收曲线（2同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物同一物质对不同波长光的吸光度不同；同一物质不同浓度，其吸收曲线形状相似。质不同浓度，其吸收曲线形状相似。 吸收曲线是特征的，可以提供物质的结构信息，作吸收曲线是特征的，可以提供物质的结构信息，作为物质定性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中为物质定性分析的依据之一；吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。选择入射光波长的重要依据。 当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分光被组成此溶液的有一部分光在溶液的表面

42、反射或分散，一部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。物质所吸收，只有一部分光可透过溶液。 入射光入射光 = 反射光反射光 分散光分散光 吸收光吸收光 透过光透过光 如果我们用蒸馏水如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂或组成此溶液的溶剂)作为作为“空白去校正空白去校正反射、分散等因素造成的入射光的损失，那么：反射、分散等因素造成的入射光的损失，那么： 入射光入射光 = 吸收光吸收光 十十 透过光透过光 吸光度吸光度A ：物质对光的吸收程度。：物质对光的吸收程度。定义：定义： AlgI0/It)A越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。越大，表示对光的吸收越大，透过光越弱。 176

43、0年朗伯(Lambert)阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系：Ab 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系：Ac 二者的结合称为朗伯二者的结合称为朗伯比耳定律，比耳定律， Abc A AlglgI0/It)= b c I0/It)= b c 式中：式中：A A，吸光度，无量刚；，吸光度，无量刚； b b，液层，液层厚度厚度( (光程长度光程长度) )，cmcm； c c，溶液的浓度，溶液的浓度， mol mol L -1 L -1 ； (epsilon) (epsilon)称为摩尔吸光系数，称为摩尔吸光系数，Lmol-Lmol-cm-1cm-1，仅与入

44、射光波长、溶液的性，仅与入射光波长、溶液的性质及温度有关，与浓度无关。质及温度有关，与浓度无关。上式表明：当一束单色光通过溶液时，其吸光上式表明：当一束单色光通过溶液时，其吸光度与溶液浓度和宽度的乘积成正比。度与溶液浓度和宽度的乘积成正比。 透光度透光度( (透光率透光率)T )T ：透过光和入射光强度之比，即：透过光和入射光强度之比，即T= It /I0 T= It /I0 100%100%T T越大，表示对光的吸收越小。越大，表示对光的吸收越小。 朗伯朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件单色光单色光 应选用应选用 max处或肩峰处测定处或肩峰处测定. 稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间

45、作用增浓度增大，分子之间作用增强强. 吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系, 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等). 无论哪一类分光光度计都包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表。分光光度计各部件的次序如图所示: 光光 源源: : 分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，分光光度计上常用的光源有两种：钨丝灯或氢灯，在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源；在在可见光区、近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源；在紫外光区多使用氢灯。紫外光区多使用氢灯。 单色器：把混合光波分解为单

46、单色器：把混合光波分解为单波长光的装置。在分光波长光的装置。在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件。光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件。 吸收池：（比色杯、比色皿、比色池一般由玻璃、石吸收池：（比色杯、比色皿、比色池一般由玻璃、石英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低于英或熔凝石英制成，用来盛被测的溶液。在低于350 nm350 nm的紫外光的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 吸收池比色皿必须与光束方向垂直。此外，吸收池比色皿必须与光束方向垂直。此外，每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都误差。比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底会显著地影响其透光性，因此在使用前务必彻底清洗。清洗。 检测器：常用光电池、光电管和光电倍增管检测器：常用光电池、光电管和光电倍增管三种。三种。 测量仪表：一般常用的紫外