农杆参考菌介导法

1、实验九植物遗传转化农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌（A,“儿Ee万必诵5）具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关：1 .Ti质粒（tumor-inducingplasmid）上的T-DNA（transferredDNA）T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能

2、力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。LB（一链）5GTTTACACCACAATATATCCTGCCA3RB（+链）5TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC32 .Ti质粒上的Vh区（virulenceregion）操纵子转化所必需的基因有汨A、B、C、D、E、Go其中蛋白VirDl/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T一链5共价结合，带有1个核定位信号NLS：VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下：讪八和而田组成型表达形成Vir

3、A和VirG蛋白一VirA被植物创伤信号分子激活一激活的VirA使VirG激活一激活的VirG诱导TC、D、E、B、F、H表达。3 .农杆菌染色体基因组相关基因：，加A、MvB（农杆菌运动、附着）、。加D、chvE（编码单糖结合蛋白、趋化性）、pscA、akcel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。4 .寄主细胞表面受体5.诱导条件：小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS,acetosyringone）.羟基乙酰丁香酮（OH-AS,hydroxyacetosyringone）:它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植

4、物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS.农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。高浓度的肌醇可促进讪基因的表达。低pH：pH5.1-5.8时Vir区基因的诱导达到最高水平。合适的温度：25-28。旧D及MG的活化必须低于283农杆菌转化的关键步骤包括：农杆菌识别并定殖于植物细胞植物受伤信号

5、分子诱导农杆菌v。基因表达T链形成T复合体及毒性因子输入寄主胞质T链进入寄主细胞核T链整合至寄主基因组T-DNA基因表达转化成功与否、转化效率的高低，除了与上述因素有关外，还与植物材料本身的状态有关。一般要选择活力高、细胞分裂旺盛的材料作为转化受体。就水稻而言，授粉后12-15d的幼胚、幼胚及成熟胚来源的胚性愈伤组织均是很好的受体材料。三、实验材料水稻幼胚或胚性愈伤组织含目的基因质粒的农杆菌（带有潮寄素抗性筛选基因如无菌滤纸四、仪器设备及用具（一）仪器设备超净工作台恒温摇床培养箱台式高速离心机涡旋仪抽滤器高压火菌锅电子天平酸度计培养室（二）用具微量移液器金属药匙牙科手术钩或细菌涂布器100mL

6、无菌三角瓶直径9cm培养皿200吨及11也即枪头枪形镜五、试剂及培养基（一）试剂二甲基亚碉（DMSO）乙酰丁香酮（AS）头抱客素（Cefazollinsodium）竣芳青霸素（Carbenicillinsodium）潮霉素（Hygromycin）卡那霉素（Kanamycin）链霉素（Streptomycin）（二）培养基1 .水稻愈伤组织培养基N6ma+B5nik.n+B5vit+2,4-D2mg/L+CH300mg/L+L-proline500mg/L+L-glutamine500mg/L+sucrose30g/L+agar7.5g/LpH5.82 .筛选培养基N6nia+B5nikm+B5

7、vit+2,4-D2mg/L+CH300mg/L+L-proline500mg/L4-L-glutamine500mg/L+sucrose30g/L+agar7.5g/L+Hm50mg/L+cefa250mg/L+carb250mg/LpH5.8注：cef,carb,Hm等抗生素不能高压灭菌，应事先配成1000倍母液，抽滤除菌后冻存。培养基灭菌后冷却至约70,在超净工作台内各加入1/1000V上述三种抗生素母液，摇匀，分装为25mL/皿。半开皿盖让平板冷却凝固后封皿。4保存。3 .农杆菌YM培养基（单位:g/L）KH2PO40.5+NaCl0.2+MgSO4.7H2O0.2+Mannitol1

8、0+L-Glutamine2+Yeastextract0.3+Agar15+Km5Omg/L4-Sm50mg/LpH7.0（抗生素Km和Sm不能高压灭菌：农杆菌培养基中加入何种抗生素要视农杆菌菌株和所含工程质粒带何种筛选标记基因而定）4 .农杆菌悬浮液MSmacro+B5mkn+B5Vh+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+inositol2g/L+sucrose30g/L+ASlOOpmol/LpH5.55 .共培养基MSmacro+B5mim+B5vil+2,4-D2mg/L4-CH500mg/L+inositol2g/L+sucrose30g/L+ASlOOpinol/L+agar

9、7.5g/LpH5.5六、实验步骤1 .农杆菌活化取保存于一70的农杆菌菌种，涂布于YM培养基平板，2728培养23九再取该平板长出的菌落涂布于新的YM平板，2728。培养2-3）此时的农杆菌可用于转化。2 .愈伤组织预培养在转化前4-5d,挑取色泽新鲜、淡黄色、颗粒状的愈伤组织继代于水稻培养基，25C暗培养。2皿/人,50块/皿。3 .农杆菌侵染用药匙将农杆菌从平板上刮出，接入农杆菌悬浮液，充分搅匀，置于摇床上，25clOOrpm摇菌约lh将愈伤组织（231nm大小，50块）投入菌液感染20min,取出置于滤纸吸干表而水分。全部接入1皿共培养基（共培养基表而事先放一张灭菌滤纸，愈伤组织均匀摆放在滤纸上）,半开皿盖在工作