利用CD41敲除小鼠构建ITP模型以及HLA-G在ITP发病中的研究

1、利用CD41敲除小鼠构建ITP模型以及HLA-G在ITP发病中的研究第一部分利用CD41敲除小鼠构建ITP模型研究背景：免疫性血小板减少症(Immunethrombocytopenia,ITP),既往称之为特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP),是由各种免疫因素介导的出血性疾病,患者主要表现为血小板计数的显著降低以及出血风险的明显增高,伴或不伴有出血症状。ITP首选的治疗方案包括肾上腺糖皮质激素和静脉输注丙种球蛋白，同时促血小板生成类药物(如重组人血小板生成素)、抗CD2M克隆抗体(利妥昔单抗)、免疫抑制剂(如环孢素、达那唑、长春新

2、碱)等其他药物以及脾切除手术等诸多方案为ITP患者的治疗带来了希望,但临床上仍有约1/3的患者对既有的治疗方案反应欠佳、最终进展成为难治性ITP患者。为深入研究ITP的发病机制以及试验新的治疗方案,理想的ITP小鼠模型变得尤为重要。根据小鼠模型的致病特点,可以将其分为三类:被动型ITP小鼠模型、继发型ITP小鼠模型以及主动型ITP小鼠模型。前两种小鼠模型对于研究免疫球蛋白的致病机制、治疗以及继发性ITP的机制有着积极作用,但对于临床上更为常见的慢性ITP发病机制的探究应用,显得有所不足。鉴于此,Semple实验室用野生型(Widetype,WT)小鼠的血小板免疫CD61敲除(Knockout,

3、KO)小鼠、再将CD61KO、鼠的脾脏细胞注射给严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency,SCID)小鼠,建立了一种新的主动型ITP小鼠模型。这种小鼠模型有力地促进了慢性ITP的发病机制及治疗方案等方面的研究。然而，有研究证实，CD61KOI鼠的胎盘缺陷较为普遍(高达25%),且产后出血概率也高于WT、鼠，这严重影响了胚胎及子代小鼠的存活率，增加了动物饲养的成本。CD41同样作为巨核细胞/血小板的表面标志，是否可以利用CD41KO、鼠替代CD61KO小鼠、构建主动型ITP模型，我们进行了相关的研究。目的：探究是否可以利用CD41KO、鼠构建主动型ITP模型

4、。方法:1、检测CD41KO小鼠的胎盘是否正常、胎鼠以及新生小鼠的出血情况。2、将野生型小鼠的血小板通过尾静脉输注给CD41KO小鼠，待CD41KO小鼠的外周血抗体阳性率达到标准后，摘取并研磨其脾脏细胞，注射给SCID小鼠，检测SCID小鼠的血小板变化、外周血抗体情况以及骨髓中巨核细胞的变化。3、将野生型小鼠的血小板通过尾静脉输注给CD41KO小鼠,待CD41KO小鼠的外周血抗体阳性率达到标准后,摘取并研磨其脾脏细胞,先进行磁珠分选,再将分选过后的脾脏细胞注射给SCID小鼠，检测SCID小鼠的血小板变化、外周血抗体情况以及骨髓中巨核细胞的变化。4、将野生型小鼠的血小板通过尾静脉输注给CD41K

5、O小鼠，待CD41KO小鼠的外周血抗体阳性率达到标准后，摘取并研磨其脾脏细胞，注射给切除脾脏的SCID小鼠，检测SCID小鼠血小板以及外周血抗体情况。结果:1、在孕14天时检测小鼠的胎盘及胎鼠,与野生型孕鼠相比,CD41KO孕鼠的胎盘没有明显的异常、子宫及胎鼠没有明显的出血、胎鼠个数也没有明显的减少；在生后3天检测小鼠，CD41KO新生小鼠皮肤黏膜没有明显的出血。2、与注射未免疫野生型小鼠血小板的CD41KO、鼠脾细胞/或者相等剂量PBSS冲液的对照组SCID小鼠相比，注射免疫野生型小鼠血小板的CD41KO小鼠脾细胞的实验组SCID小鼠的血小板明显降低、且不会恢复，其外周血抗体明显增多，其骨髓

6、中成熟巨核细胞明显减少。3、与注射未进行细胞分选的脾细胞的对照组SCID小鼠相比，注射去除了CD8+卫田胞的脾细胞后的实验组SCID小鼠的骨髓成熟巨核细胞的计数明显增多,证实CD8+TM胞或会影响巨核细胞的成熟。4、给脾脏切除的SCID小鼠注射相应的脾脏细胞，与未进行脾切除的对照组SCID小鼠相比，其外周血中的抗体量明显减少,尽管其血小板有一定程度的回升、但仍不能完全恢复至辐照前水平。结论:、主动型ITP小鼠模型能够更好地模拟慢性ITP的发病过程、探究不同细胞成分在ITP发病中的作用。2、CD41KO、鼠可以替代CD61KO、鼠、构建切实有效的主动型ITP小鼠模型。第二部分HLA-G在ITP发

7、病中的研究研究背景:ITP是临床上以血小板计数显著降低为主要特征、并排除其他原因导致血小板减少的一种自身免疫性出血性疾病,其发病机制主要为抗血小板自身抗体介导的血小板破坏增多以及巨核细胞成熟障碍导致的血小板生成减少。ITP患者原本正常的免疫耐受状态被打破,抗血小板自身抗体的产生(主要是针对血小板表面糖蛋白(glycoprotein,GP)、细胞毒性T细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTLs)的异常活化、辅助性T细胞(helperTcells,Th)亚群中Th1/Th2比例的失衡等,都会不同程度地导致血小板的减少。除此之外，调节性T细胞(regulatoryTcells,Tre

8、gs)、调节性B细胞(regulatoryBcells,Bregs)、耐受性树突状细胞(dendriccells,DCs)、髓源抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,MDSCs)等多种细胞异常的免疫激活与免疫抑制,亦参与了ITP发病过程。人白细胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G,HLA-G)是一种非经典的主要组织相容性复合体I类抗原，较经典的HLA-I类抗原而言，HLA-G的多态性程度低，主要有4种膜结合型的HLA-G1HLA-G2HLA-G3HLA-G4以及3种可溶性的HLA-G5HLA-G6HLA-G7蛋白。HLA-G可通过与相应

9、受体结合而发挥广泛的免疫调节功能，这些受体包括免疫球蛋白样转录物2(immunoglobulin-liketranscript2,ILT2/LILRB1/CD85j)免疫球蛋白样转录物4(immunoglobulin-liketranscript4,ILT4/LILRB2/CD85d)以及杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killercellimmunoglobulin-likereceptor,KIR2DL4/CD1158d)。其中,ILT2与ILT4被证实是抑制性受体,KIR2DL4可能具有抑制与活化双重功能。ILT2多见于单核细胞、DCsB细胞、T细胞以及部分自然杀伤细胞(naturalkill

10、ercells,NKs)等表面,ILT4局限表达于髓源性单核细胞及DCs上,这两种ILTs是HLA-G外周免疫细月fi的主要受体；而KIR2DL4则位于子宫蜕膜的NKs表而。HLA-G作为体内重要的免疫抑制分子，在自身免疫性疾病的研究中也越来越受到重视。有研究发现,类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)患者、多发性硬化患者、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者等自身免疫性疾病患者的HLA-G表达水平降低，且低水平的HLA-G与疾病活动性明显相关。而关于HLA-G与ITP的发病机制的关联，尚需进一步研究证实。我们猜测，HLA-

11、G或可在ITP的发病机制中有着一定的免疫调控功能，并进行了相关实验验证。目的：探究HLA-G在ITP发病中的作用及调控机制方法：1、样本采集:收集30例ITP患者外周血作为实验组、15例健康人的外周血作为对照组。2、分离血浆、分选淋巴/单核细胞:密度梯度离心法分离、收集外周血的血浆/血清、单个核细胞(peripheralbloodmonocytecells,PBMCs),免疫磁珠分选法分选CD4+TM6、CD14+I核细胞。3、酶联免疫标记法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测ITP患者以及正常对照组血浆中HLA-G的表达情况。4、改良单克隆抗体血

12、小板抗原固定实验(modifiedmonoclonalantibody-specificimmobilizationofplateletantigen,MAIPA)检测ITP患者抗血小板自身抗体的表达情况。5、ELISA法检测ITP患者及正常对照组血清中多种细胞因子的表达水平。6、细胞培养：CD14加核细胞培养体系中，加入粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6),5天后,加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/或重组人HLA-G

13、蛋白(recombinedhumanHLA-G,rhHLA-G)继续培养2天，进行相关检测。CD4+TS胞培养体系中，加入CD3ft体、重组人IL-2(recombinanthumanIL-2,rhIL-2),再加入一定数量的DCs域rhHLA-G,5天后，进行相关检测。结果:1、与正常对照组相比，抗血小板自身抗体阳性的患者，其HLA-G水平明显降低，而抗血小板自身抗体阴性的ITP患者，其HLA-G水平则无明显差异。2、与正常对照组相比，ITP患者CD4+T细胞以及CD14单核细胞表面的mHLA-Gfe达水平明显降低，其CD4+TM胞表面的ILT2以及CD14中核细胞表面的ILT4表达水平均明显降低，而rhHLA-G可以上调上述ILTs的表达水平。3、rhHLA-G能够纠正ITP患者的PBMC分泌紊乱的细胞因子：加入rhHLA-G后,TNF-a、IL-12以及IL-17的水平明显降低，而IL-10、IL-2、IL-4、IL-10、G-CSF以及GM-CSF勺水平明显升高。4、ITP患者与正常对照组的成熟DCs表面CD80CD86的表达均明显增多，且患者组高于正常对照组；而在加入rhHLA-G后，两组成熟DCsg面CD80CD8