高级生物化学PPT_蛋白质的研究方法ppt课件

1、1 蛋白质的研讨方法蛋白质的研讨方法 2主要内容v蛋白质对象的选择和样品的获取蛋白质对象的选择和样品的获取v蛋白质的检测和鉴定蛋白质的检测和鉴定v蛋白质的构造分析蛋白质的构造分析v蛋白质生物功能检测蛋白质生物功能检测 3 蛋白质对象的选择和样品的蛋白质对象的选择和样品的获取获取4 一、研讨对象的选择一、研讨对象的选择无论何种来源的生物资料普通都含有无论何种来源的生物资料普通都含有成千上万种不同的蛋白质分子；成千上万种不同的蛋白质分子；在一种生物组织中，同时存在着多种在一种生物组织中，同时存在着多种蛋白质组分。虽然它们都具有肽链构蛋白质组分。虽然它们都具有肽链构造，但在分子大小、极性以造，但在分

2、子大小、极性以及电荷上会有所差别。及电荷上会有所差别。 5 选择研讨蛋白的原那么：选择研讨蛋白的原那么： 在组织中含量比较高在组织中含量比较高 相对比较稳定的蛋白质如血液中的相对比较稳定的蛋白质如血液中的HbHb；肌肉中；肌肉中的的 肌球蛋白和肌动蛋白等肌球蛋白和肌动蛋白等从方式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机从方式生物基因组测序结果来看，每一种生物有机体体内都还有大量的蛋白质内都还有大量的蛋白质5050左右从来没有被研左右从来没有被研讨讨过。过。6获取蛋白样品的方法：获取蛋白样品的方法： 直接从生物组织中提纯蛋白直接从生物组织中提纯蛋白为主为主根据基因组测序获得的信息根据基因组测序获得

3、的信息 7运用各种分辨效果好的化学及物理化学运用各种分辨效果好的化学及物理化学方法方法8直接从生物组织中提纯蛋白直接从生物组织中提纯蛋白蛋白质的分别纯化包括以下过程：蛋白质的分别纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来将有关的蛋白质分级沉淀下来; 盐析法或有机溶剂盐析法或有机溶剂法法3.运用层析法或电泳法使它们各自分开；运用层析法或电泳法使它们各自分开； 4.蛋白质结晶；蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。蛋白质纯度鉴定和含量测定。9u根据基因组测序获得的信息根据基因组测序获得的

4、信息u 1 1可以获得所要研讨的特定蛋白质的可以获得所要研讨的特定蛋白质的AAAA序列。序列。 u 先根据推出的先根据推出的AAAA序列合成对象蛋白中的一段序列合成对象蛋白中的一段肽，用它去获肽，用它去获 得有关的抗体，然后用抗体去探得有关的抗体，然后用抗体去探测蛋白质的存在，甚至可以用抗体经过亲和层析测蛋白质的存在，甚至可以用抗体经过亲和层析纯化对象蛋白纯化对象蛋白102 2去获得有关基因的去获得有关基因的cDNAcDNA全序列，然后全序列，然后经过重组经过重组DNADNA技术去表达重组蛋白。技术去表达重组蛋白。 有偏向，甚至完全是假象。有偏向，甚至完全是假象。 即使推测得到的蛋白质编码信息

5、是对的，即使推测得到的蛋白质编码信息是对的，在细胞内还存在转录后的在细胞内还存在转录后的RNARNA加工，翻译后加工，翻译后的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前的蛋白质的修饰和加工等基因序列上目前还无法反映的信息。还无法反映的信息。11制备过程中本卷须知：制备过程中本卷须知： 要求自始至终坚持在天然形状要求自始至终坚持在天然形状 防止一切过激要素防止一切过激要素-如过酸或过碱，高温，如过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。重金属等的影响。2. 2. 通常都在低温条件下操作。通常都在低温条件下操作。3. 3. 尽能够使样品中蛋白质的浓度维持在较尽能够使样品中蛋白质的浓度维持在较高高 程度。程度。1

6、2二、细胞的破碎二、细胞的破碎 少数蛋白质少数蛋白质-存在于细胞外面如血液存在于细胞外面如血液和体液中和体液中 大多数蛋白质大多数蛋白质-都存在于细胞的里面。都存在于细胞的里面。 普通固形生物资料首先都必需加以破碎，普通固形生物资料首先都必需加以破碎，以释放出细胞内的蛋白质组分。以释放出细胞内的蛋白质组分。 生物资料生物资料 必需新颖必需新颖要求：要求： 1. 资料资料 -80 2. 或者制成干粉或者制成干粉 3. 低温存放低温存放 破碎的方法：破碎的方法：机械破碎法：机械破碎法： 利用机械力的搅切作用，使细胞利用机械力的搅切作用，使细胞研碎研碎高速搅切器、玻璃匀浆器、家用高速搅切器、玻璃匀浆

7、器、家用搅肉器、研钵、搅肉器、研钵、玻璃珠高速匀浆器以及静压器玻璃珠高速匀浆器以及静压器高压破碎。高压破碎。2.浸透破碎法：浸透破碎法： 利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。利用低渗条件，使细胞溶胀破碎。 红血球放于水中，便发生自溶。红血球放于水中，便发生自溶。143.3.交替冻融法：交替冻融法： 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。而使细胞胀破。 4. 4.超声波法：超声波法： 利用超声波震荡，使细胞膜上所受张利用超声波震荡，使细胞膜上所受张力不均而解体。力不均而解体。 5. 5.酶消化法：酶消化法： 利用蛋白酶、溶菌酶、蜗牛复合酶等利用蛋白酶、溶菌酶

8、、蜗牛复合酶等对对细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体细胞膜或细胞壁的分解作用，使它们解体15按其所在位置大体可分为：按其所在位置大体可分为：两种类型外周蛋白经过次级键和外膜脂质两种类型外周蛋白经过次级键和外膜脂质的的极性头螯合在一极性头螯合在一同同 固有蛋白固有蛋白外周蛋白外周蛋白-选择适当离子强度及选择适当离子强度及pHpH的含有的含有EDTAEDTA的的 缓冲液抽提高盐溶液缓冲液抽提高盐溶液固有蛋白固有蛋白-嵌合在膜双层中，它经过疏水作嵌合在膜双层中，它经过疏水作用与用与 膜内部脂质层的疏水性尾部相膜内部脂质层的疏水性尾部相结合，结合， 具有具有螺旋构造。螺旋构造。三、去污剂处置溶解膜蛋

9、白三、去污剂处置溶解膜蛋白膜蛋白的处置：复杂膜蛋白的处置：复杂 细胞膜的构造细胞膜的构造17 膜固有蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，根本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。 去污剂：去污剂：一类具有一类具有 亲水性头部亲水性头部 疏性尾巴疏性尾巴 的双亲性的双亲性amphipathic脂类分子脂类分子作用：作用： 既可以破坏细胞的磷脂双层构造，又可以与既可以破坏细胞的磷脂双层构造，又可以与具有疏水性外表的膜蛋白结合，从而阻止释放具有疏水性外表的膜蛋白结合，从而阻止释放出来的膜蛋白经过疏水相互作用构成大的、可出来的膜

10、蛋白经过疏水相互作用构成大的、可沉淀的聚集体。沉淀的聚集体。 19有的去污剂的亲水性头部可离子化即含有一带电有的去污剂的亲水性头部可离子化即含有一带电基团基团 如：如： 脱氧胆酸钠脱氧胆酸钠sodium deoxycholatesodium deoxycholate 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠sodium dodecylsulfatesodium dodecylsulfate，SDSSDS有的去污剂不能解离，所以分子中短少带电基团，有的去污剂不能解离，所以分子中短少带电基团， 如：如： Triton X-100 Triton X-100， 辛基葡萄糖苷辛基葡萄糖苷( octylglucosi

11、de( octylglucoside20临界微团浓度临界微团浓度critical micelle concentration，CMC)： 每一种去污剂都具有一特征性的每一种去污剂都具有一特征性的CMC。 CMC值与其分子中疏水部分与亲水部分的构造有值与其分子中疏水部分与亲水部分的构造有 关。关。 当当去污剂去污剂低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中低于此值的时候，去污剂分子在水溶液中将不构成微团，到达此值的时候，微团开场构成。将不构成微团，到达此值的时候，微团开场构成。 21 离子化去污剂离子化去污剂SDS：其其“疏水尾巴破坏蛋白质分子的疏水尾巴破坏蛋白质分子的疏水性部分的构造，其带电的疏水性

12、部分的构造，其带电的“头头部破坏蛋白质分子中的氢键和离部破坏蛋白质分子中的氢键和离子键。子键。作用的结果是：作用的结果是： 使任何蛋白不论是膜蛋白还使任何蛋白不论是膜蛋白还是水溶性蛋白都发生完全变性，是水溶性蛋白都发生完全变性，并溶解在水溶液中，同时失去生物并溶解在水溶液中，同时失去生物活性。活性。在部分情况下，当去污剂被透析掉在部分情况下，当去污剂被透析掉后，蛋白质可以复性并恢复生物活后，蛋白质可以复性并恢复生物活性。性。 22SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-SDS-polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide

13、gel electrophoresis，SDS-SDS-PAGEPAGE：就是利用就是利用SDSSDS的这种结合在整个蛋白分子上，并的这种结合在整个蛋白分子上，并使蛋白完全变性的特性。使蛋白完全变性的特性。这样经过这样经过SDSSDS变性的蛋白质在电场中完全按大小变性的蛋白质在电场中完全按大小别分开。别分开。 23非离子去污剂：非离子去污剂：相对温暖，普通不会使蛋白量变性。只是将相对温暖，普通不会使蛋白量变性。只是将蛋白质分子从膜上溶解下来而已。蛋白质分子从膜上溶解下来而已。当当 去污剂去污剂 其其CMCCMC值的时候，去污剂分子与值的时候，去污剂分子与膜蛋白外表的疏水区域结合，使蛋白质在水膜

14、蛋白外表的疏水区域结合，使蛋白质在水溶液中溶解而不聚集。溶液中溶解而不聚集。当当 去污剂去污剂 其其CMCCMC值的时候，去污剂分子将值的时候，去污剂分子将与膜磷脂一同构成混合微团，膜蛋白以整合与膜磷脂一同构成混合微团，膜蛋白以整合在微团中的方式存在。在微团中的方式存在。普通选择非离子去污剂来坚持膜蛋白生物活普通选择非离子去污剂来坚持膜蛋白生物活性性 25 四、蛋白分子的稳定四、蛋白分子的稳定防止蛋白质分子能够被同时释放的蛋白防止蛋白质分子能够被同时释放的蛋白质水解酶降解、质水解酶降解、Pr空间构造能够被温度空间构造能够被温度或化学试剂等环境要素破坏而丧失生物或化学试剂等环境要素破坏而丧失生物

15、学活性等。学活性等。处置：需求在缓冲液中参与蛋白酶抑制处置：需求在缓冲液中参与蛋白酶抑制剂；剂； 在低温下操作；在低温下操作； 参与稳定剂参与稳定剂(如甘油等如甘油等26五、细胞碎片的去除五、细胞碎片的去除离心离心( centrifugation) ( centrifugation) 原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量原理：悬浮在溶液中的两个或多个不同质量或密度的颗粒如细胞、细胞器、大分子复或密度的颗粒如细胞、细胞器、大分子复合体、或分子等沉降到试管的底部的速度合体、或分子等沉降到试管的底部的速度是不一样的，质是不一样的，质量越大、或密度越高沉降的速度越快。量越大、或密度越高沉降的速度越快

16、。沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离沉淀：固体性的细胞碎片和细胞器沉降到离心管的心管的底部构成；底部构成；上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保管上清：绝大多数蛋白分子或蛋白复合体保管在细胞在细胞抽提液中即上清中抽提液中即上清中 27 六、目的蛋白质的分别、纯化六、目的蛋白质的分别、纯化 -蛋白质的分级沉淀和层析分蛋白质的分级沉淀和层析分别别将不同蛋白质分开的性质主要包括：将不同蛋白质分开的性质主要包括： 分子量的大小分子量的大小 带电情况带电情况 水溶性水溶性 与某种物质的特异高亲和与某种物质的特异高亲和力等力等 28蛋白质的胶体性质：蛋白质的胶体性质： 蛋白质颗粒外表多为亲水基团，可吸引

17、水分子，使颗粒外表成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。蛋白质颗粒外表多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒外表成有一层水膜，蛋白质颗粒相互隔开，不会聚集成大颗粒而沉淀。 此外，蛋白质外表可带有电荷，可起胶粒稳定的此外，蛋白质外表可带有电荷，可起胶粒稳定的作用。作用。 假设去除蛋白质胶体外表电荷和水化膜两个稳定要素假设去除蛋白质胶体外表电荷和水化膜两个稳定要素 ，蛋白质极易从溶液中析出，蛋白质极易从溶液中析出 29#30 一蛋白质的分级沉淀一蛋白质的分级沉淀 常用的方法有：常用的方法有： 盐析法盐析法 有机溶剂法有机溶剂法31 盐析法盐析法 概念：将中性盐参与蛋白质溶液，破坏水

18、化膜概念：将中性盐参与蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及盐析所需的盐浓度及pH不同，参与不同浓度的不同，参与不同浓度的中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。中性盐可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点：操作简便优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的维护作用，对易变性的蛋白质有一定的维护作用， 适用范围非常广泛。适用范围非常广泛。 缺陷：分辨才干差缺陷：分辨才干差32 1.根本原理根本原理在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种在蛋白质水溶液中添加无机盐，可以产生两种影响：影响： (1)盐离子与盐离子与Pr分

19、子中的分子中的 极性基团极性基团 离子基团离子基团 作用作用 降低降低Pr分子的活度系数，趋使其溶解度分子的活度系数，趋使其溶解度 。(2)盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活 度降低，导致度降低，导致Pr水合程度的减少，从而趋使水合程度的减少，从而趋使Pr溶溶 解度解度 。33 * *盐溶盐溶salting in)-salting in)-当溶液中的盐离子强度比较当溶液中的盐离子强度比较低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的添加而低的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的添加而添加，这种景象叫做添加，这种景象叫做. .* *盐析盐析salting

20、out )-salting out )-但当溶液中的盐离子强度但当溶液中的盐离子强度比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的添比较高的时候，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的添加而降低，这种景象叫做加而降低，这种景象叫做 . .一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶一定的盐浓度下，每一种蛋白都有一不同的特异溶解度。解度。 34 影响盐析作用的要素影响盐析作用的要素 1盐的种类盐的种类 2pH和温度和温度# 3蛋白质浓度蛋白质浓度%351盐的种类盐的种类对同一种对同一种Pr而言，价数愈高的盐离子，盐析而言，价数愈高的盐离子，盐析才干才干也愈强也愈强: PO3-4SO42-C2O42-CHOHC

21、OO-2 ACCLNO3-Br -I- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 负离子价数较高的中性盐如硫酸盐、磷酸负离子价数较高的中性盐如硫酸盐、磷酸盐等的盐等的Ks值常较一价中性盐的值常较一价中性盐的Ks值高。值高。 Ks:盐析常数价数较高时，盐析常数价数较高时，Ks 值也较大。值也较大。代表盐析的效率，代表盐析的效率， 是与是与Pr及盐种类有关的特及盐种类有关的特性常数。性常数。36硫酸铵常用盐析剂硫酸铵常用盐析剂 优点：盐析才干较强优点：盐析才干较强 具有较高的溶解度具有较高的溶解度 价钱低廉价钱低廉 不产生副作用。不产生副作用。 缺陷：缓冲才干较差缺陷：缓冲才干较差 pH难控制难控制3

22、72 2pHpH和温度和温度S S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于除取决于PrPr的种类，还受的种类，还受pHpH及温度影响及温度影响: : pH=pI pH=pI时，时，S S。的数值极小。的数值极小 S S。随温度添加而减低。随温度添加而减低。盐析过程中，假设增高温度，有助于盐析过程中，假设增高温度，有助于PrPr的析出。的析出。# #383蛋白质浓度蛋白质浓度 Pr较高，在较低无机盐浓度时较高，在较低无机盐浓度时,蛋白质便蛋白质便开开 始析出，盐析界限比较宽。始析出，盐析界限比较宽。 Pr较低，需求无机盐的浓度也高，即盐较低，需求无机盐的浓度

23、也高，即盐析析 界限变窄。界限变窄。 39 蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低。 但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用但蛋白质浓度愈高时，其他蛋白质的共沉淀作用 也愈强也愈强 所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释，所以当蛋白质溶液太浓时，应适当稀释， 通常在通常在2.53.0之间比较适宜。之间比较适宜。401.1.根本原理根本原理1 1在在pIpI附近，附近，PrPr主要以中性离子方式存在。主要以中性离子方式存在。此时假设添加此时假设添加 有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电有机溶剂，由于有机溶剂可使溶液电离常数减小，加强了离常数减小，加强了 中性离

24、子间静电引力，从而使分集中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。合而沉淀出来。2 2有机溶剂本身的水协作用会破坏有机溶剂本身的水协作用会破坏PrPr外表的外表的水合层，也水合层，也 促使促使PrPr变得不稳定而聚集析出变得不稳定而聚集析出. .常用的有机溶剂：乙醇和丙酮常用的有机溶剂：乙醇和丙酮 有机溶剂法有机溶剂法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好分辨力比盐析方法高，提纯效果好 41 2. 影响有机溶剂沉淀Pr的要素 1 pH值 pH=pI时 蛋白质的溶解度最低。按pI来调理pH值， 有利于分别。 2蛋白质浓度 Pr越高，参与一定量有机溶剂后，Pr析出越多。 此时溶液的介电常数也相应提高，

25、可以减少Pr的变性。 Pr越高,Pr分子间作用引起的共沉淀景象也显著 加强，这样分别效果差，不利于分级沉淀。 只需选择恰当的Pr才有能够获得良好的分别效果。423 3离子强度离子强度 中性盐的参与能促使中性盐的参与能促使PrPr在有机溶剂中溶解，在有机溶剂中溶解， 并且能防止并且能防止PrPr的变性。但含盐过多，却会使的变性。但含盐过多，却会使PrPr 过度析出，不利于分级沉淀。过度析出，不利于分级沉淀。 普通普通0.05M0.05M的稀盐溶液。的稀盐溶液。4 4多价阳离子多价阳离子 Pr Pr与多价的阳离子如与多价的阳离子如 Zn2+ Zn2+、 Cu2+ Cu2+等能结等能结 合成复合物。

26、这种复合物在有机溶剂中往往使合成复合物。这种复合物在有机溶剂中往往使PrPr 溶解度变小。溶解度变小。 43v常温下有机溶剂可使蛋白量变性，低温条件下可减慢变性速常温下有机溶剂可使蛋白量变性，低温条件下可减慢变性速度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进展。度。因此用有机溶剂沉淀蛋白质时应在低温条件下进展。v如利用丙酮沉淀蛋白质时，必需在如利用丙酮沉淀蛋白质时，必需在0 044低温下进展，丙酮低温下进展，丙酮用量用量- -般般1010倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立刻分别，否那么蛋白质会变性。立刻分别，否那么蛋白质会变性。v缺陷：缺陷

27、：v 易使酶和具有活性的蛋白量变性。故操作时要求条件比盐易使酶和具有活性的蛋白量变性。故操作时要求条件比盐析严厉。对于某些敏感的酶和蛋白质，运用有机溶剂沉淀尤析严厉。对于某些敏感的酶和蛋白质，运用有机溶剂沉淀尤其要小心。其要小心。 44 (二蛋白质的层析分别法二蛋白质的层析分别法 色谱法色谱法 原理原理层析法是利用不同物质理化层析法是利用不同物质理化性质的差别而建立起来的技术。一切性质的差别而建立起来的技术。一切的层析系统都由两个相组成：一是固的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分别的混定相，另一是流动相。当待分别的混合物随流动相经过固定相时，由于各合物随流动相经过固定相时

28、，由于各组分的理化性质存在差别，与两相发组分的理化性质存在差别，与两相发生相互作用吸附、溶解、结合等生相互作用吸附、溶解、结合等的才干不同，在两相中的分配含量的才干不同，在两相中的分配含量比不同，且随流动相向前挪动，各比不同，且随流动相向前挪动，各组分不断地在两相中进展再分配。分组分不断地在两相中进展再分配。分部搜集流出液，可得到样品中所含的部搜集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而到达将各组分分别各单一组分，从而到达将各组分分别的目的。的目的。45 层析分别才干的本质层析分别才干的本质物质的分配问题物质的分配问题 *分配系数：分配系数： 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定

29、相和当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和挪动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分配系数。挪动相两相内的浓度之比是一个常数，这称为分配系数。 Cs Cm *质量分配系数：质量分配系数：假设不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，那么称为质量假设不用浓度而用物质的绝对量的比值来表示，那么称为质量分配系数即：分配系数即： Vs Vm Vs : 固定相的体积固定相的体积 Vm : 流动相的体积流动相的体积K =D= K*46 种类：种类： 气相层析气相层析 按两相形状来分按两相形状来分 液相层析液相层析 吸附层析吸附层析 分配层析分配层析 按层析机理来分按层析机理来分 离子交换层析离子

30、交换层析 凝胶排阻层析凝胶排阻层析 亲和层析亲和层析 柱层析柱层析 按操作方式来分按操作方式来分 薄层层析薄层层析 纸层析纸层析层析法分别、纯化：层析法分别、纯化：Pr、多肽和、多肽和AA47 离子交换层析法离子交换层析法*原理：阴阳离子交换树脂颗粒作为固定相原理：阴阳离子交换树脂颗粒作为固定相 填充在层析柱内，由于阴阳离子交换树填充在层析柱内，由于阴阳离子交换树 脂颗粒上带正负电荷，能吸引溶液中的脂颗粒上带正负电荷，能吸引溶液中的 阴阳离子。然后再用含阴阳离子的阴阳离子。然后再用含阴阳离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，添加阴离子浓度，

31、含负电量多的蛋白下来，添加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。4849固定相：固定相：1.1.纤维素纤维素- - 二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素DEAEDEAE纤维纤维素、素、 羧甲基纤维素羧甲基纤维素CMCM纤维素纤维素2.2.葡聚糖葡聚糖50纤维素纤维素 : 骨架为柔性长链骨架为柔性长链1. 参与量参与量 ： 参与层析柱的蛋白质量通常为纤维参与层析柱的蛋白质量通常为纤维素量的素量的 非常之一。非常之一。2. 提高分辨率，样品体积应尽能够地提高分辨率，样品体积应尽能够地少。少。3. 在洗脱时，可以经过改动洗脱缓冲

32、在洗脱时，可以经过改动洗脱缓冲液的液的pH， 而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下而使蛋白质分子电荷减少而被解吸下来，也来，也 可以经过提高洗脱缓冲液中离子强度，可以经过提高洗脱缓冲液中离子强度，减弱减弱 蛋白质分子与载体亲和力的方法，将蛋白质分子与载体亲和力的方法，将蛋白质蛋白质 组分逐一洗脱下来。组分逐一洗脱下来。51葡聚糖的离子交换树脂葡聚糖的离子交换树脂 :骨架为三维网状构造骨架为三维网状构造 优点：优点：1.同时具有分子筛的作用同时具有分子筛的作用2. 因其高度的网状构造，所带有的交换基团也比纤维因其高度的网状构造，所带有的交换基团也比纤维 素多得多。交换容量为离子交换纤维素的素多得多。

33、交换容量为离子交换纤维素的35倍。倍。 缺陷：缺陷： 它的床体积常受它的床体积常受pH或盐浓度影响而变化，对分别或盐浓度影响而变化，对分别效果有一定程度的干扰。效果有一定程度的干扰。 52凝胶排阻层析凝胶排阻层析又称分子筛或凝胶过滤又称分子筛或凝胶过滤gel filtration原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。凝胶。 当分子大小不同的混合物经过这种凝当分子大小不同的混合物经过这种凝胶柱时，胶柱时， 直径大于孔径的分子将不能进入凝胶直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，内部， 便直接沿胶粒间隙流出全排出。便直接沿胶粒间隙流出全排出。较小的较小的 分子

34、进入能包容它的孔穴，绕道而行，分子进入能包容它的孔穴，绕道而行，在柱在柱 内保管时间就比较长。这样，较大的内保管时间就比较长。这样，较大的分子被先分子被先 洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而来，从而 到达相互分别的目的到达相互分别的目的.5354用作凝胶的载体物质有三类：用作凝胶的载体物质有三类： 交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶 商品名为商品名为 Sephadex G Sephadex G 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 商品名为商品名为Bio-gel PBio-gel P ( (丙烯酰胺丙烯酰胺 + N + N，N N- -次甲基二丙烯酰次甲基二丙烯酰胺聚合

35、而成胺聚合而成 P P值表示不同的交联度值表示不同的交联度) ) 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 商品名为商品名为 Sepharose Sepharose或或 Bio-gel A Bio-gel A 从海藻琼脂中分别除去琼脂胶后从海藻琼脂中分别除去琼脂胶后的中性级成分的中性级成分 是是D-D-半乳糖和半乳糖和3,6-3,6-脱水脱水-L-L-半半乳糖相间反复结乳糖相间反复结 合而成的链状化合物合而成的链状化合物55常用过滤层析凝胶的截留分子量范围56琼脂糖凝胶优点：琼脂糖凝胶优点：1.1.其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝其机械强度比葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝 胶好得多。胶好得多。2.2.对蛋白质等高分

36、子的吸附作用也小得多对蛋白质等高分子的吸附作用也小得多3.3.适用分子量的范围宽，最大可以到适用分子量的范围宽，最大可以到108108。57吸附层析法吸附层析法原理：柱层析中，含有原理：柱层析中，含有Pr分子的混合物随流分子的混合物随流动相通动相通 过由吸附剂组成的固定相时，过由吸附剂组成的固定相时，Pr分子分子经过各经过各 种次级作用可以吸附在吸附剂上种次级作用可以吸附在吸附剂上,由于由于不同分不同分 子的吸附才干不同，可以经过洗脱使子的吸附才干不同，可以经过洗脱使它们逐它们逐 一解脱出来，而使混合物得以分别。一解脱出来，而使混合物得以分别。优点：优点：1. 物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也

37、比较物理吸附，吸附能量比较低，洗脱也比较容易。容易。2.操作简便，吸附剂容易获得，价钱较低廉操作简便，吸附剂容易获得，价钱较低廉 58固定相：固定相：吸附剂吸附剂磷酸钙凝胶磷酸钙凝胶磷酸钙胶磷酸钙胶Ca3Ca3PO4PO42 2磷酸氢钙胶磷酸氢钙胶CaHPO42H2OCaHPO42H2O羟基磷酸钙胶羟基磷酸钙胶Ca5Ca5PO4PO43OH 3OH 羟基磷灰石羟基磷灰石 磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理磷酸钙胶对蛋白质的吸附作用原理: :主要是由于主要是由于 . Ca2+. Ca2+与与PrPr负电荷性基团负电荷性基团 结合。结合。 . . 磷酸基团与磷酸基团与PrPr正电荷基团正电荷基团59

38、流动相：流动相： 洗脱剂洗脱剂-柠檬酸盐柠檬酸盐作用：柠檬酸离子因与作用：柠檬酸离子因与Ca2+有更强的相互有更强的相互作用，作用， 它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附才干。它能大大降低蛋白质和凝胶的吸附才干。 NaCl，KCl甚至浓度高达甚至浓度高达3M时，也不影时，也不影响响Pr负电荷的吸附，相反这些盐可以大大负电荷的吸附，相反这些盐可以大大降低降低Pr正电荷的吸附。因此在高浓度的这正电荷的吸附。因此在高浓度的这些盐溶液中运用羟基磷灰石进展层析时，可些盐溶液中运用羟基磷灰石进展层析时，可以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除以专门吸附酸性蛋白质及中性蛋白质而排除碱性蛋白质。碱性蛋白质。60亲和

39、层析法亲和层析法1.原理：利用生物高分子具有能和某些相对原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专注应的专注 分子可逆结合的特性。分子可逆结合的特性。 如，酶的活性部位能和底物如，酶的活性部位能和底物抑制剂抑制剂辅助辅助因子专因子专 一性地结合一性地结合,改动条件又能使这种结合改动条件又能使这种结合解除解除. 酶的变构中心与变构因子或称效应酶的变构中心与变构因子或称效应物之物之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结结 合蛋白与结合物之间合蛋白与结合物之间。 这些被作用的对象物质称之为配基这些被作用的对象物质称之为配基ligand) 。 61固定相固定相-配

40、基固定在固相载体上配基固定在固相载体上62632.2.优点：具有高度的吸附专注性优点：具有高度的吸附专注性 层析过程简便、快速层析过程简便、快速3.3.载体的选择：载体的选择：(1)(1)必需具有高度亲水性，使必需具有高度亲水性，使PrPr分子容易与它接近分子容易与它接近. .(2)(2)非专注性吸附要非常小。非专注性吸附要非常小。(3)(3)必需具有大量可供活化而能与配基结合的基团。必需具有大量可供活化而能与配基结合的基团。 常用载体：纤维素、常用载体：纤维素、 葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、 聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。聚丙烯酸胺凝胶和多孔玻璃等。 64高效液相层析法高效

41、液相层析法High Performance High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatography ，HPLCHPLC又称又称“高压液相色谱，是色谱法的一个高压液相色谱，是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分别后，进入检测器在柱内各成分被分别后，进入检测器进展检测，从而实现对试样的分析

42、。进展检测，从而实现对试样的分析。 65HPLC包括： 输液系统：驱动流动相和样品经过色谱分别柱和检测系统 层析柱：分别样品中的各个物质 进样器：将待分析样品引入色谱系统 检测系统：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号 ，并分析显示出来6667 蛋白质的检测和鉴定蛋白质的检测和鉴定68 普通可经过以下几个方面进展：普通可经过以下几个方面进展： 光谱学特性光谱学特性 电泳行为电泳行为 特异抗体反响特异抗体反响 特异生物学活性特异生物学活性 N一末端氨基酸序列测定一末端氨基酸序列测定 质谱检测质谱检测 排阻层析排阻层析 69 一、光谱学特性一、光谱学特性 光谱特性的总原那么是：光谱

43、特性的总原那么是： 当一定波长的光即电磁波与当一定波长的光即电磁波与Pr分子接触时，所吸收的或反射的辐分子接触时，所吸收的或反射的辐射能量与射能量与Pr分子构造特征和浓度是分子构造特征和浓度是亲密相关的。亲密相关的。 70 不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反不同波长范围的电磁波与其作用后的剩余能量值反映的是蛋白质分子的不同特征映的是蛋白质分子的不同特征: :190 -200nm190 -200nm波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链波长范围的光吸收反映的是蛋白质主链上的酰胺键中电子的被激发；上的酰胺键中电子的被激发；230 - 300nm230 - 300nm波长范围的光吸收谱最大吸收

44、值在波长范围的光吸收谱最大吸收值在280nm280nm波优点反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸波优点反映的是蛋白质分子中芳香族氨基酸侧链上电子的被激发。侧链上电子的被激发。所以普通情况下，溶液在所以普通情况下，溶液在280nm280nm波优点属紫外波优点属紫外光范围的光吸收才干被当做是存在蛋白质的证据。光范围的光吸收才干被当做是存在蛋白质的证据。71二、电泳检测二、电泳检测 蛋白质分子为两性电解质，在不同蛋白质分子为两性电解质，在不同pH的溶液中带有不同的电荷，从而在直的溶液中带有不同的电荷，从而在直流电场中可以泳动，这就是电泳景象。流电场中可以泳动，这就是电泳景象。按介质形状来分按介质形状来分

45、:自在电泳自在电泳 区带电泳区带电泳按操作原理可分为按操作原理可分为: 普通电泳普通电泳 等电电泳等电电泳 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 免疫电泳等免疫电泳等 72自在电泳自在电泳-以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分别以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分别 缺陷缺陷:自在电泳过程中分散严重，分辨率有限自在电泳过程中分散严重，分辨率有限区带电泳区带电泳-在固体支持物上所进展的电泳在固体支持物上所进展的电泳 固体支持物有固体支持物有:滤纸、滤纸、 醋酸纤维薄膜、醋酸纤维薄膜、 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 优点优点:分辨率很高。分辨率很高。73SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰

46、胺凝胶电泳 SDSSDS ( (十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )是是阴离子型去污剂阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate, (Sodium dodecyl sulfate, SDS)SDS)SDSSDS一凝胶电泳可以按蛋白一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。质分子大小的不同将其分开。 这时，假设以分子量的对数这时，假设以分子量的对数logMlogM对相对于染料前沿对相对于染料前沿的迁移率的迁移率RfRf作图，呈现作图，呈现线性关系。线性关系。 ab7475 这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的分子量范围：分子量范围：

47、 5 5胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量6 6200200万的区间；万的区间； 10 10胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.61.67 7万的区间；万的区间； 15 15胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.21.24.54.5万的区间。万的区间。 等电聚焦电泳等电聚焦电泳isoelectric focusing, isoelectric focusing, IEFIEF 是一种根据样品的等电点不同而使它是一种根据样品的等电点不同而使它们在们在pHpH梯度中相互分别的一种电泳技术。梯度中相互分别的一种电泳技术。 利用特殊的一种缓冲液两性电解质利用特殊的一种缓

48、冲液两性电解质在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶内制造一个在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶内制造一个pHpH梯度。梯度。 pH pH梯度制造利用的两性电解质梯度制造利用的两性电解质ampholyteampholyte，商品名为商品名为ampholineampholine，是脂肪族多胺和多羧，是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的类的同系物，他们具有相近但不同的pKapKa和和pIpI值。在外电场作用下，自然构成值。在外电场作用下，自然构成pHpH梯度。梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等葡聚糖凝胶等77Pr分子有一定的pI，它处在一个由阳极到

49、阴极梯度逐渐添加的介质中，并经过以直流电时，它便“聚焦在与其pI一样的pH位置上。pI不同的蛋白质泳动后构成位置不同的区带而得到分别。78优点：优点：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以区分等电点只需可以区分等电点只需 0.01 pH 0.01 pH单位差别的蛋白质；单位差别的蛋白质；3.3.根据其所在位置还可以测定蛋白质的分子量；根据其所在位置还可以测定蛋白质的分子量；4.4.对很稀的样品，最后到达高度的浓缩。对很稀的样品，最后到达高度的浓缩。79双向电泳双向电泳two-dimensional gel electrophoresis 第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳第一向

50、采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-pI第二向采用第二向采用SDS一一PAGE电泳电泳 -分子量分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不完全不同的特一性来进展分别，因此具有非常高的同的特一性来进展分别，因此具有非常高的分辨率分辨率可同时分析成千上万个蛋白，分辨率高，分可同时分析成千上万个蛋白，分辨率高，分别度好。别度好。是蛋白质组学研讨的中心技术。是蛋白质组学研讨的中心技术。80双向PAGE81 双向电泳技术缺陷，具有以下特征双向电泳技术缺陷，具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：测到：等电点等电点pI)值很大或

51、很小的，比值很大或很小的，比如大于如大于8和小于和小于4的那些蛋白质；的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如大分子质量很大的蛋白质，比如大于于l00kDa的蛋白的蛋白质就比实践的少了，而大于质就比实践的少了，而大于150kDa的蛋白质就几的蛋白质就几乎完全探测不到了虽然在一维乎完全探测不到了虽然在一维电泳凝胶上这些电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被察看到；大蛋白质都能清楚地被察看到；疏水性蛋白质。疏水性蛋白质。 免疫电泳免疫电泳 将电泳分别和专注性免疫沉淀相结合的分将电泳分别和专注性免疫沉淀相结合的分析方法：析方法： 免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫电泳法是指利用凝胶电泳与双向免疫分散两

52、种技术结合的实验方法。在电免疫分散两种技术结合的实验方法。在电场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同场作用下标本中各组分因电泳迁移率不同而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶而分成区带，然后沿电泳平行方向将凝胶挖一沟槽，将抗体参与沟槽内，使抗原与挖一沟槽，将抗体参与沟槽内，使抗原与抗体相互分散而构成沉淀线。根据沉淀线抗体相互分散而构成沉淀线。根据沉淀线的数量、位置及外形，以分析标本中所含的数量、位置及外形，以分析标本中所含组分的性质。组分的性质。由于免疫反响有由于免疫反响有很高的专注性，很高的专注性，可用于鉴定可用于鉴定PrPr的的纯度，分析样品纯度，分析样品中蛋白质的组分。中蛋白质的组分。PH

53、8.6本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。本实验常用于抗原分析及免疫性疾病的诊断。8384三、测定纯化蛋白质的分子大小三、测定纯化蛋白质的分子大小 测定蛋白处于非变性条件下的大小普通可经过：测定蛋白处于非变性条件下的大小普通可经过：凝胶层析凝胶层析沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 动态光散射动态光散射dynamic light scattering)孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳孔径梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳pore gradient polyacrylamide gel electrophoresis 85

54、凝胶层析 1.凝胶是一类多孔性高分子聚合物,每个颗粒犹如一个筛子.当样品溶液经过凝胶柱时,相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙,随着溶剂流动,因此流程较短,向前挪动速度快而首先流出层析柱; 2. 反之,相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔,可自在地进出凝胶颗粒的网孔,在向下挪动过程中,它们从凝胶内分散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入与逸出,使流量增长,挪动速率慢而最后流出层析柱.863. 而中等大小的分子,它们也能在凝胶颗粒内外分布,部分进入颗粒,从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱.这样,经过层析柱,使混合物中的各物质按其分子大小不同而被

55、分别 。 VeblogMw C其中b,C为常数。即Ve为洗脱体积，与logMw也成线性关系。我们可以经过在一凝胶柱上分别多种知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出规范曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。87沉降平衡超速离心沉降平衡超速离心sedimentation equlibrium ultracentrifugation) 用该技术测定蛋白质分子质量的时用该技术测定蛋白质分子质量的时候，测定的是几个绝对动力学参数。候，测定的是几个绝对动力学参数。原理：当原理：当PrPr样品在相对较低的离心速度但样品在相对较低的离心速度但还是处于超速范围下离心时，在一个从离还是处于超速范围

56、下离心时，在一个从离心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降心管顶部指向底部的、越往底部越大的沉降力作用下，力作用下，PrPr分子很快构成一个从离心管顶分子很快构成一个从离心管顶部往下逐渐添加的延续部往下逐渐添加的延续r r浓度梯度；与此同浓度梯度；与此同时，将有一个方向与离心力相反的分散力作时，将有一个方向与离心力相反的分散力作用于用于PrPr上；当沉降离心进展一定时间之后，上；当沉降离心进展一定时间之后，作用于作用于PrPr上的离心力和分散力前者与蛋白上的离心力和分散力前者与蛋白在离心管中所在位置离轴心的间隔成正比例，在离心管中所在位置离轴心的间隔成正比例，后者与后者与PrPr浓度成正比正好

57、相互消除，这样浓度成正比正好相互消除，这样使得蛋白样品的外表处于一个平衡形状而不使得蛋白样品的外表处于一个平衡形状而不再挪动再挪动. .在这种平衡条件下，不同部位在这种平衡条件下，不同部位PrPr浓度与所在浓度与所在部位离轴心的间隔之间的关系与蛋白质分子部位离轴心的间隔之间的关系与蛋白质分子质量成某种数学关系。正是经过这种关系，质量成某种数学关系。正是经过这种关系，可以测定蛋白质的分子量。可以测定蛋白质的分子量。89密度梯度离心90 动态弹性光散射动态弹性光散射 是经过测定蛋白颗粒的直径、然后是经过测定蛋白颗粒的直径、然后与规范蛋白样品比较而推算蛋白分与规范蛋白样品比较而推算蛋白分子质量的方法

58、。子质量的方法。这种测定技术也可经过察看样品是这种测定技术也可经过察看样品是单分散性的单分散性的monodispersed还是还是多分散性的多分散性的polydisper-sed而反映所测蛋白样品能否均一。而反映所测蛋白样品能否均一。 91 孔径梯度电泳孔径梯度电泳 这是经过制备具有一定范围的从这是经过制备具有一定范围的从大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，大到小孔径梯度的聚丙烯酸胺凝胶，然后让蛋白在非变性条件下在这种然后让蛋白在非变性条件下在这种凝胶上电泳而进展的。凝胶上电泳而进展的。经过低电流条件下的较长时间的电经过低电流条件下的较长时间的电泳，蛋白质分子将在凝胶中与其直泳，蛋白质分子将在凝胶

59、中与其直径相等的孔径处停下由于再往下径相等的孔径处停下由于再往下凝胶中的孔径比蛋白直径小。经凝胶中的孔径比蛋白直径小。经过与同时在胶中电泳的规范样品比过与同时在胶中电泳的规范样品比较我们就可以知道蛋白在这种非变较我们就可以知道蛋白在这种非变性条件下的分子质量。性条件下的分子质量。 优点：优点：.所获得的是天然形状下的所获得的是天然形状下的蛋白分子大小。蛋白分子大小。 2. 假设蛋白分子可以在这假设蛋白分子可以在这种低电流电场中长种低电流电场中长 时间坚持稳定的话，这时间坚持稳定的话，这种方法比种方法比 较经济。较经济。92 质谱质谱 质谱是一种在化学中被广泛采用质谱是一种在化学中被广泛采用的、

60、测定原子或分子质量方法中最的、测定原子或分子质量方法中最直接、最准确的方法。直接、最准确的方法。 93 用质谱测定蛋白质分子质量的用质谱测定蛋白质分子质量的总的原理：总的原理：首先纯化好的蛋白样品要被转首先纯化好的蛋白样品要被转变成挥发和带电即解离形变成挥发和带电即解离形状，电离后的蛋白质分子带状，电离后的蛋白质分子带有多个电荷然后进人一个真有多个电荷然后进人一个真空加速电场中，之后，不同质空加速电场中，之后，不同质荷比荷比m/z的蛋白分子表现的蛋白分子表现出的行为或者在外加磁场中出的行为或者在外加磁场中的偏转、或者抵达固定探测器的偏转、或者抵达固定探测器的所谓的所谓“飞行时间飞行时间time