林蛙抗菌肽基因原核表达载体的构建及表达条件的优化

1、项目编号：KFJJ-大学生开放性实验基金项目申 请 书项目名称：林蛙抗菌肽基因原核表达载体的构建及表达条件的优化申 请 人：汪 林所在院系：生命科学学院指导教师：李 治联系电话：88038248申报时间：2008年6月填 表 须 知 一、陕西师范大学大学生开放性实验基金项目申请表要按顺序逐项填写，内容要实事求是，表达要明确、严谨。空缺项要填“无”。要求一律用A4纸打印，于左侧装订成册。 二、申请参加陕西师范大学大学生开放性实验基金项目团队人数不得超过5人（1人为项目负责人，项目参与者1-4人）。三、陕西师范大学大学生开放性实验基金项目申请表由申报学生所在学院初审，签署意见后，一式三份（均为原件

2、），报送实验室建设与管理处。四、如填表有不明事宜，请与实验室建设与管理处联系和咨询。（联系电话：85310378）一、基本情况项目名称林蛙抗菌肽基因原核表达载体的构建及表达条件的优化项目来源自拟课题 综合设计 科学研究 计算机应用 人文素质起止时间2008年6月至2009年6月申请人姓名学院、专业、年级学号项目中的分工联系电话签 名负责人汪林生科院05级生物基地班40508047参与所有实验内目参加人岑文生科院06级生物技术班40608217参与所有实验内川生科院06级生物技术班40608216参与所有实验内小玉生科

3、院06级生物基地班40608180参与所有实验内导教师姓名学院职称研究方向联系电话签 名李治生科院副教授抗菌肽功能及应用88038248项目所依托的实验室分子微生物学实验室摘要（不超过300字）：抗菌肽具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，是理想的抗生素替代品。蛙类的皮肤分泌液含有大量的抗菌肽类物质，目前已经分离的蛙类抗菌肽超过数百种。然而直接从蛙类提取纯化抗菌肽存在多方面问题。如，从蛙类皮肤分类纯化抗菌肽工艺繁琐费时、产量小；从蛙类皮肤提取抗菌肽必然需要处死蛙，这样对物种保护、环境保护等也会造成不好的影响。因此，本项目拟在前期实验基础上，以基因工程技术构建含有林蛙抗菌肽基

4、因的原核表达载体，于体外表达抗菌肽；并优化原核系统表达抗菌肽的条件，期望可以通过体外表达的方式大量合成抗菌肽，为后期抗菌肽的开发利用提供技术支持。二、申请书正文1、立项依据（研究项目的意义、国内外研究现状、和发展动态）研究意义：抗菌肽是由10-50个氨基酸残基组成，常带正电荷。其分子量小，理化性质稳定、水溶性好、热稳定性好，同时具有广谱抗菌、抗病毒、抗癌能力，并具有活性浓度低、无致畸变作用、无蓄积毒性、不易引起病原产生耐药性等优点，而且作为生物体的天然绿色产物，是理想的抗生素替代品。两栖类动物皮肤长期裸露，在自然选择的过程中，为抵御有害环境因子侵袭逐渐形成了一系列保护机制，即它们的皮肤分泌液含

5、有大量的杀菌和防御天敌的抗菌肽类物质；目前已经分离的两栖类抗菌肽超过数百种。然而，直接以蛙类作为提取纯化抗菌肽的来源，存在多方面问题。如，从蛙类皮肤分类纯化抗菌肽存在工艺繁琐费时、产量小的问题；从蛙类皮肤提取抗菌肽必然需要处死蛙，这样对物种保护、环境保护等也会造成不好的影响。因此，本项目拟在前期实验基础上，以基因工程技术构建含有林蛙抗菌肽基因的原核表达载体，于体外表达抗菌肽；并优化原核系统表达抗菌肽的条件，期望可以通过体外表达的方式大量合成抗菌肽，为后期抗菌肽的开发利用提供技术支持。研究现状及发展动态：1970年，Csordas等在研究欧洲铃蟾皮肤分泌物中的向性细胞性物质时发现了第一个具有溶血

6、作用的蛙皮抗菌肽Bombinin；1987年，Zasloff从非洲爪蟾的皮肤分泌物中提取得到magainin蛙皮抗菌肽。迄今为止，国内外对蛙类分泌物中生物活性肽的研究有四十多年历史，涉及500多种蛙类。所分离的抗菌肽按照其结构特征可以分为多个家族，主要有Magainin、Bombsnin、Bombinin-like、Brevinin、Eseulentin、Ranatuerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin家族等。目前对两栖类抗菌肽的功能研究发现，抗菌肽不仅具有抗菌（包括细菌和真菌）活性，很多抗菌肽还有抗肿瘤活性、抗病毒活性、抗原虫活性、抗精

7、子作用及溶血作用等。目前，随着对蛙皮多肽分子结构与生物功能研究的不断深入，已将其应用到医药、食品、农业等多个领域。国内许多学者都对其所在地区的特有两栖类种属进行了大量的研究，其中比较突出的是对云南臭蛙属以及长白山林蛙的研究。目前尚未有研究者对我省秦岭山区分别的中国林蛙进行抗菌肽方面的研究工作。分子微生物学实验室在前期的工作中，从秦岭林蛙皮肤中分离、克隆了数个抗菌肽基因，经过分析比较，均为未报道的新基因。本实验在前期基础上，拟研究新抗菌肽基因的表达特征。2、项目的主要内容和创新点、拟解决的关键问题主要内容：以基因工程技术构建含有林蛙抗菌肽基因的原核表达载体，于体外表达抗菌肽；并优化原核系统表达抗

8、菌肽的条件，期望可以通过体外表达的方式大量合成抗菌肽，为后期抗菌肽的开发利用提供技术支持。创新点：本实验拟表达的林蛙抗菌肽基因为分子微生物实验室获得的一个新基因，从未有其他研究报道。拟解决问题：通过实验研究优化抗菌肽体外表达的条件，为后期抗菌肽的开发利用积累实验数据，并提供技术支持。3、研究方案（技术路线）及可行性分析研究方案：第一部分：原核表达载体的构建1) 引物设计：根据已克隆的林蛙抗菌肽基因(lw-3)设计引物2) 原核表达载体制备：提取质粒(pGEX-6p-1)，进行酶切得到载体3) 目的基因的获得：提取含有lw-3基因的克隆载体质粒，以其为模板，用1）中设计好的引物进行PCR扩增，酶

9、切获得插入片段4) 连接和转化：将纯化回收插入片段和载体，在T4噬菌体连接酶的作用下进行连接反应；连接产物转化至感受态细胞HB1015) 阳性克隆的筛选：将转化产物涂布至含抗生素的固体培养基上培养，进行抗性筛选；再以菌落PCR和质粒双酶切两种方法对克隆进行的进一步鉴定6) 测序：对阳性克隆进行序列测定第二部分：原核表达载体的诱导表达1） 构建表达菌株：将确定的原核表达载体pGEX6p1-lw3转入表达菌株BL21中2） 诱导表达：将表达菌株接种培养至OD6000.6时，用IPTG诱导lw-3基因表达；表达4hr后收集表达产物3） 表达产物检测：将表达产物制备为蛋白质电泳样品，进行SDS-PAG

10、E电泳，检测表达结果4） 表达条件优化：分别优化接种量、培养时间、培养温度、IPTG浓度等因素，获得最佳表达条件可行性分析：本实验相关的微生物学、分子生物学及生物化学等相关学科的理论知识及技术方法我们都已经学习了。本项目所依托的分子微生物学实验室也能够提供研究所需的材料、试剂及相关仪器设备。相信在李治老师的指导下，我们可以完成相关的研究内容。4、研究计划2008年6月10月： 原核表达载体的构建2008年10月： DNA测序 (送交上海生工公司完成)2008年11月2009年1月：原核表达载体的诱导表达及表达效果检测2009年2月-4月： 表达条件的优化2009年5月-6月： 整理实验结果，完成项目结题报告；论文写作及投稿5、成果形式及预期结果获得一个含有新抗菌肽基因的基因工程表达菌株发表论文1篇经费预算支出类别预算金额（元）主要用途实验耗材800实