水稻与白叶枯病菌互作的基因表达谱分析与差异性表达基因的识别

1、水稻与白叶枯病菌互作的基因表达谱分析与差异性 表达基因的识别吴茂森，田 峰，齐放军，何晨阳（中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100094）摘要：【目的】从基因组水平上阐明水稻在与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)感病互作条件下基因表达反应的特征。【方法】用cDNA-AFLP方法对Xoo接种处理不同时间的水稻细胞进行基因表达谱分析。【结果】在测定的大约4 000个水稻cDNA片段中，363个(9.1%)是差异性表达的，其中295个受Xoo诱导上调表达，68个被抑制下调表达。根据在不同互作时间点的表达特征，它们可分为7

2、种表达类型。对31个差异片段的序列同源性进行分析，发现它们在己公布的水稻全基因组中完全相同的序列，但只有10个基因具有已知或推断的生物学功能，其余21个基因功能未知。用荧光实时定量PCR分析法证实了cDNA-AFLP基因表达结果。【结论】构建了水稻Xoo感病组合在细胞水平上互作的基因表达谱，从基因组水平上识别了一批受Xoo诱导或抑制表达、与水稻感病反应相关的基因，这些新基因的发现为开展水稻感病功能基因组学的研究提供了材料。关键词：水稻；白叶枯病菌；cDNA-AFLP；表达谱；差异性表达基因cDNA-AFLP Analysis of Gene Expression Response to Xan

3、thomonas oryzae pv. oryzae and Identification of Genes Expressed Differentially During this Compatible Interaction in Rice Suspension Cultured CellsWU Mao-sen, TIAN Feng, QI Fang-jun, HE Chen-yang（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chi

4、nese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100094）Abstract: 【Objective】The study was conducted to elucidate the gene expression response of rice to bacterial inoculation with Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) at the genomic levels. 【Method】cDNA-amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP

5、) was employed to analyze the gene expression patterns of mock- and Xoo-inoculated rice suspension cultured cells. 【Result】Three hundred and sixty-three (9.1%) from approximately 4 000 cDNA fragments analyzed were differentially regulated (295 up-regulated and 68 down-regulated) 0.5, 3, 24 h after c

6、o-cultivation with Xoo. Seven gene expression patterns of the differential fragments were identified. Ten of 31 sequenced fragments showed homology to genes with known or putative functions involved in metabolism, pathogen response and signaling. 21 others did not show any homology to sequences with

7、 known functions. cDNA-AFLP differential patterns for 5 selected genes were confirmed via real-time reverse transcription PCR analysis. 【Conclusion】Gene expression profiling in response to Xoo and differentially expressed genes of rice were revealed and identified via cDNA-AFLP analysis. This work b

8、egins to reveal potential disease susceptibility-related genes of this staple crop with global importance.Key words: Rice; Xanthomonas oryzae pv. oryzae; cDNA-AFLP; Gene expression profiling; Differentially expressed genes0 引言【研究意义】水稻白叶枯病不仅是世界水稻生产上最重要的细菌性病害之一1，而且已成为当今植物病原物互作研究的模式系统之一2。通过基因转录谱技术对水稻与白

9、叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）互作后的基因表达谱进行分析，有利于从基因组水平上全面认识水稻与Xoo之间复杂的互作关系。【前人研究进展】在过去十几年里，水稻Xoo互作研究主要集中在水稻抗病和Xoo致病分子机理方面2,3，对于水稻感病分子机理研究却鲜有报道。随着水稻和Xoo全基因组序列的相继发表4,5以及基因组学技术的发展，为水稻Xoo互作的功能基因组学研究奠定了基础。植物基因转录谱是基于基因转录水平上的一种研究新技术，用于分析不同条件下整个基因组的基因表达方式和功能6。cDNA-AFLP是一种基于RNA指纹的基因表达谱的检测方法，与基于PCR的基因

10、差异表达分析方法和DNA微排阵法相比，具有重复性好、假阳性低、灵敏度高以及不要求已知基因序列等优点7，已被广泛用于植物8,9、微生物10,11和动物12,13基因表达谱的研究。通过分析植物病原菌互作条件下的基因表达谱，不仅有助于了解互作过程中基因表达规律，还可以发现和挖掘植物与抗/感病性相关的新基因1419。【本研究的切入点】以水稻培养细胞系和Xoo 感病互作组合体系为材料，用cDNA-AFLP方法分析水稻的基因表达反应及其图谱，鉴别差异性表达的基因。【拟解决的关键问题】本研究为深入研究这些基因在水稻Xoo互作中的作用，开展水稻感病性功能基因组学的研究奠定基础。1 材料与方法1.1 水稻悬浮细

11、胞培养和Xoo接种处理参照文献20进行。将水稻品种日本晴（Oryzae sativa L. cv. Nipponbare）种胚接种在附加2 mg·L-1 2，4-D的MS培养基上诱导，诱导形成的愈伤组织转至相同培养基中继代培养，20 d继代培养1次。生长状态良好的愈伤组织接入附加1.5 mg·L-1 2，4-D的MS液体培养基中，在28，100 r/min条件下震荡培养。悬浮细胞每星期更换新鲜培养基继代培养数代。选取最后一次更换培养基并继代培养34 d，生长状态良好、均一的悬浮细胞用于实验。将水稻细胞均匀分装至（1 g 细胞/10 ml培养基）50 ml 三角瓶，再适应培养

12、24 h后进行Xoo接种处理。将Xoo菌株JXO I接种到NB中，振荡培养至OD600 =1.2，离心收集菌体，用MS洗涤2次，用相同培养基重新悬浮菌体。用浓度为107cfu/ml的菌悬液接种水稻细胞，以未接种的水稻细胞为对照。互作接种共培养0.5、3、24 h后，分别收获水稻细胞，液氮冷冻后贮存于-80备用。1.2 水稻RNA提取和cDNA合成将4 g水稻细胞液氮冷冻研磨成粉末，加入80预热的RNA抽提缓冲液（100 mmol·L-1 Tris-HCl，100 mmol·L-1 LiCl，10 mmol·L-1 EDTA，1% SDS，pH 8.0）与TE饱和酚

13、的等体积混合液振荡混匀；加入1/2体积氯仿，振荡混匀；离心取上清，氯仿抽提至两相界面干净为止。上清中加入1/3体积8 mol·L-1 LiCl，0沉淀过夜。离心收集沉淀，75%乙醇洗涤后真空干燥，溶于TE。测定总RNA浓度，检测完整性和纯度。按照PolyATtract® mRNA Isolation System（Promega）试剂盒方法，进行mRNA提取。按照SuperScriptTM Choice System（InvitrogenTM）试剂盒方法，进行双链cDNA合成。1.3 cDNA-AFLP试验按照文献21进行。双链cDNA经TaqI和AseI双酶切后，连接上T

14、aqI和AseI接头。接头和引物序列分别为：TaqI接头序列5-GACGATGAGTCCTGAC-35-CGGTCAGGACTCAT-3AseI接头序列5-CTCGTAGACTGCGTACC-35-TAGGTACGCAGTC-3TaqI 预扩增引物序列5-GACGATGAGTCCTGACCGA-3AseI预扩增引物序列5-CTCGTAGACTGCGTACCTAAT-3TaqI选择性扩增引物序列5-GATGAGTCCTGACCGANN-3（N：任意碱基）AseI选择性扩增引物序列5-GACTGCGTACCTAATNN-3（NN：AA，AC，AG，AT）用-32PdATP 标记选择性引物。扩增产物

15、经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳。进行放射自显影分析。1.4 差异表达片段分离和测序比对放射自显影结果，将差异条带从聚丙烯酰胺凝胶上切下，浸泡水中，80处理10 min，离心取上清作为模板，用选择性引物进行PCR扩增，分离基因片段。用ABI Prism 377测序仪（Perkin Elmer）进行序列测定。用BLAST（NCBI）进行基因序列同源性分析。1.5 实时定量PCR分析以相同处理的第一链cDNA为模板，根据己测定的差异片段的序列重新合成相应的特异性引物，用iCycle IQ Real-Time PCR仪（Bio-Rad）进行荧光实时定量PCR检测。试验按照IQ Sybr Green Supe

16、rmix试剂盒（Bio-Rad）方法进行。2 结果与分析2.1 cDNA-AFLP分析为了解水稻细胞与Xoo互作后不同阶段的基因表达动态，分别选择不同互作时间点（0.5、3和24 h）收获水稻细胞，以未处理（0 h）为对照，提取mRNA，反转录合成双链cDNA后进行AFLP分析。试验中共使用了64对引物组合，每个组合大约产生6065个转录片段，大小为50350 bp（图1）。在测定的大约4 000个水稻cDNA片段中，绝大多数的表达无明显变化，但363个（9.1%）片段是差异性表达的，其中295个受Xoo诱导上调表达（7.4%），68个被抑制下调表达（1.7%）。根据在不同互作时间点的表达特征

17、，这些差异片段可分为7种表达类型（表1），其中I型（51个）和VII型（68个）片段分别在所有互作时间点上稳定上调和下调表达，II-IV型基因在互作早中期（0.5 h和/或3 h）表现出转录上调，V型片段是介于互作中后期（324 h）的转录表达增加，VI型基因在互作后期（24 h）才显示出转录增加。2.2 水稻差异性表达片段的分离与序列分析以回收差异片段为模板，用相应选择性引物进行PCR扩增，产物电泳后与cDNA-AFLP放射自显影结果进行比较分析，大约94%回收样品可重新获得扩增片段（TDF）。选择部分样品进行DNA序列测定，获得31个差异表达片段的基因序列。对这些差异片段的序列同源性进行分

18、析，发现它们在己公布的水稻全基因组中完全相同的序列，但只有10个基因具有已知或推断的生物学功能，其中包括转录调控因子BTF3基因，与抗病反应相关基因（如几丁质酶基因和PR10b基因）和与代谢相关基因（如ATP酶亚基基因、甲基丙二酸半醛脱氢酶基因、钾离子通道基因）等，其余21个基因功能尚不清楚（表2）。2.3 实时定量PCR鉴定差异表达基因片段根据差异表达片段的基因序列，合成相应的特异性引物，以与Xoo互作的水稻悬浮细胞mRNA反转录的cDNA为模板，用荧光实时定量PCR方法，对挑选的5个上调表达片段（Os18、Os22、Os74、Os79和Os82）的基因表达进行了定量分析和鉴定。结果表明，5

19、个基因片段均受Xoo诱导而上调表达，基因表达上调倍数分别为4.6、12.1、8.6、7.0和5.3。因此，这种基因表达定量分析结果与cDNA-AFLP定性分析结果是完全吻合的。AC: 试验用3对引物组合。14: 分别为水稻细胞接种Xoo 0、0.5、3、24 h的处理，每个处理重复一次。a为接种处理0.5 h样品上调条带，b为接种处理24 h样品上调条带，c为接种处理0.524 h样品上调条带，d为接种处理样品下调条带cDNAs from rice suspension culture cells mock-inoculated (lane 1) and Xoo-inoculated for

20、0.5 h, 3 h and 24 h (lanes 2-4) were amplified with different primer combinations (A-C shown only). Each set of two lanes represents duplicates of cDNA amplification of the treatment. Arrows indicate differential bands. a, bands induced by the treatment for 0.5 h; b, bands induced by the treatment f

21、or 24 h; c, bands induced by the treatment from 0.5 h to 24 h; d, bands repressed by the treatment图 水稻细胞接种Xoo不同时间后cDNA-AFLP图Fig. cDNA-AFLP display of rice cells after inoculation with Xoo3 讨论本文比较系统地报道了用cDNA-AFLP方法对Xoo接种处理的水稻细胞进行基因表达谱的分析结果。本研究使用的cDNA-AFLP技术是一种可靠易行的基因差异表达检测方法。为了确保试验结果的可靠性和可重复性，每个处理必须至

22、少设置2个重复，从水稻悬浮细胞培养、与Xoo互作接种处理、水稻mRNA提取、到cDNA-AFLP反应完全独立进行。本研究二次重复试验的基因表达条带基本一致，表明在保证试表1 7种基因表达类型的水稻差异性片段Table 1 Seven patterns of differentially expressed genes of rice类型Pattern基因表达模式 Expression patterns at the time (h) post-inoculation with Xoo数量Numbers百分比Percentage %00.5 3 24 I-+5114.1II-+-6217.1II

23、I-+-7019.3IV-+-4412.1V-+298.0VI-+3910.7VII+-6818.7总计Total363100+ 表示有AFLP条带 Positive bands; - 表示无AFLP条带 Negative bands表2 31个水稻差异性表达基因的序列同源性分析Table 2 Homologies of 31 of cDNA-AFLP fragments to sequences in the databases片段TDF No.大小Size (bp)基因表达Expression同源基因 Homology to geneE值E-value00.5 h3 h24 hOs 189

24、7-+Oryza sativa mRNA for endochitinase (X56063)1e-46Os 22148-+O. sativa pathogenesis-related protein PR-10b gene (AF274851)1e-74Os 72225-+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK105824)e-123Os 73193-+-O. sativa (japonica) dehydration-stress inducible protein 1 mRNA (AY587109)e-103Os 7475-+O. sativa meth

25、ylmalonate semi-aldehyde dehydrogenase (AF045770)1e-33Os 7970-+-O. sativa (japonica) ATPasesubunit (NM_197454)7e-31Os 82175-+-O. sativa (japonica) isolate 20946 putative transcription factor BTF3 mRNA (AY224525)2e-82Os 95238-+-O. sativa (japonica) mRNA (XM_476682)e-130Os 10160-+-O. sativa (japonica)

26、 cDNA clone (AK121174)5e-25Os 104248-+-Arabidopsis thaliana K efflux antiporter KEA1 mRNA (AF003382)3e-09Os 10680-+-O. sativa genomic DNA, chromosome 4, BAC clone (AL731623)9e-37Os 109324-+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK120839)0Os 110248-+-O. sativa (japonica), predicted mRNA (XM_474399)e-136Os

27、 11792-+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK103122)8e-44Os 164140+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK111921)3e-72Os 173187-+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK121726)e-100Os 176217-+-O. sativa (japonica) mRNA (XM_483345)e-118Os 190176+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK121056)1e-93Os 198303+-Hord

28、eum vulgare putative gene for heparanase (AJ495772)3e-86Os 20590-+O. sativa (japonica) mitochondrial DNA (AB076666)2e-28Os 208250+-Zea mays (clone pAKHSDH1) aspartate kinase-homoserine dehydrogenase (L33912)4e-79Os 216242-+-Daucus carota mRNA for neutral invertase (Y16262)1e-08Os 226237-+O. sativa (

29、japonica) cDNA clone (AK102234)e-130Os 227114-+O. sativa (japonica) cDNA clone (AK063593)7e-57Os 234149-+O. sativa (japonica) putative proton pump, mRNA (NM_195204)1e-77Os 248145-+O. sativa (japonica) mitochondrial DNA (AB076665)3e-75Os 249109-+-O. sativa (japonica) genomic DNA, chromosome 8 (AP0055

30、20)7e-54Os 250107+-O. sativa (japonica) genomic DNA, chromosome 6 (AP003512)1e-52Os 260124-+O. sativa (japonica) cDNA clone (AK104521)9e-63Os 343325-+-O. sativa (japonica) predicted mRNA (XM_472898)0Os 363137-+-O. sativa (japonica) cDNA clone (AK111107)2e-70+表示有AFLP条带 Positive bands; -表示无AFLP条带 Nega

31、tive bands验处理条件一致的前提下，cDNA-AFLP技术具有良好可重复性。此外，选择5个经cDNA-AFLP定性的差异表达基因，进行实时PCR定量分析，使用定性和定量相结合的方法，使cDNA-AFLP试验结果更为准确和可靠。由于水稻全基因组包含有大约4万个基因序列4，本研究中分析了大约1/10水稻全基因组的表达动态及其特征。在所分析的大约4 000个基因中，发现了9.1%水稻基因受Xoo接种处理的调控而差异性表达，其中上调表达基因的数量是下调表达的4.3倍。这些差异片段在互作早、中、后期具有不同的7种表达模式，可能代表这些基因在互作中发挥不同的生理功能。值得关注的是，在互作早期表现转

32、录水平上调的基因中，可能包括了早期信号途径基因和转录调控因子基因。尽管己有转录因子BTF3在人类基因组中的基因序列和功能的研究22,23，本文首次报道BTF3基因在水稻基因组中同源序列（OsBTF3）的发现及其受Xoo诱导上调表达的特征，推测其可能在水稻Xoo感病互作中起非常重要的基因表达调控作用。目前正在用基因敲除和过量表达的方法对OsBTF3基因在水稻感病抗病反应中的功能进行系统分析（待发表资料）。一般认为，植物在受到病原菌侵染时，产生包括PR10家族成员在内的病程相关（PR）蛋白，PR蛋白的产生是一种抗病表型，PR10b蛋白在侵染48 h后可被诱导24。本研究发现当水稻细胞与Xoo互作3

33、 h时，PR10b基因上调表达，表明在互作早期PR10b基因已经开始转录。因此，在与Xoo感病互作过程中，水稻可能表现部分与基础防卫相关的基因（如PR10b基因和几丁质酶基因）表达反应。此外，本研究发现PR10b基因表达时间早于以往其它研究结果，可能原因一是不同研究所使用的植株和细胞水平互作体系不同，二是由于互作早期mRNA量少，其它研究所使用的方法难以检出，而本研究采用的cDNA-AFLP方法可以对低丰度mRNA进行有效检测。本研究从水稻基因组水平上鉴别了31个与Xoo互作而差异表达的基因，尽管其中少数基因的生物学功能是己知的或推断的，但大多数基因的功能尚不清楚。运用功能基因组学的方法，进一

34、步深入研究这些重要基因的功能，将可能为从分子水平上阐明水稻Xoo互作机制及其植物感病机理提供科学依据。4 结论4.1 用cDNA-AFLP方法构建了水稻Xoo感病组合在细胞水平上互作的基因表达谱。4.2 从基因组水平上鉴别了31个受Xoo诱导或抑制表达、与水稻感病反应相关的基因。4.3 这些新发现的水稻基因为开展水稻感病功能基因组学的研究提供了材料。References1 Gnanamanickam S S, Brindha P V, Narayanan N N, Vasudevan P, Kavitha S. An overview of bacterial blight disease o

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