从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究

1、    从胚胎干细胞诱导发育为浆细胞的体外实验研究        摘要目的：建立胚胎干细胞体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为研究造血发生的基因调控及B淋巴细胞发育过程奠定基础。方法：分阶段培养，第一、二阶段使用半固体培养，分组加入细胞因子、2巯基乙醇和胚胎细胞条件培养液，用流式细胞仪、免疫组化及Wright's染色鉴定细胞，第三阶段移入骨髓基质细胞滋养层。结果：第一阶段：加入SCF、TPO、IL6、IL3、Epo、和GCSF，4 d后细胞大片坏死，仅加入2巯基乙醇可形

2、成胚胎体。第二阶段：加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢，再加入条件培养液，发育34 d可形成CD34的细胞集落。第三阶段：移至骨髓基质细胞饲养层后，发育为浆细胞。结论：胚胎干细胞在体外可定向分化为浆细胞。胚胎干细胞在早期发育不需要细胞因子，胚胎细胞的条件培养液可促使其向造血细胞发育，骨髓基质细胞饲养层可使其向浆细胞分化。主题词胚胎；干细胞；细胞活素类；造血干细胞；浆细胞 Induction of plasma cells from embryonic stem cells in vitro cultureQIAO Chun-Ping, LI Shu-Nong,HUANG Shao-Liang,

3、XU Ling, LIANG Xiao-Yan, ZHANG Xiu-MingDepartment of Pathophysiology, Sun-Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou(510089)AbstractAIM：To find a suitable microenviroment for improved induction of plasma cells from murine embryonic stem(ES)cells,we explored the roles of cytokines and primary

4、bone marrow stromal cells in the development of ESD3 cells.METHOD and RESULTS：The process was divided into three stages.First stage(04 day):adding SCF(stem cell-factor) ，TPO(thrombopoietin)，IL6，IL3，erythropoietin，GCSF into methycellulose culture,ESD3 cells died four days later,ESD3 cells developed i

5、nto embryoid bodies and they grew well in the presence of 2Mercaptoethanol (2-ME) only.Second stage(47 dyas)：the embryoid bodies were trypsined,then transferred into secondary methylcellulose culture,cells grew slowly when adding SCF and TPO, but they(86%)developed quickly into the colonies of CD34

6、cells in the presence of conditional medium(first stage of liquid culture,adding 2ME only).Third stage:CD34 cells developed into CD34 CD38 cells when transferred onto prepared bone marrow stromal cells in the presence of IL6 and SCF,they looked like plasma cells by cell morphology,and immunoglobulin

7、 test was positive .CONCLUSIONS：Cultured in a suitable microenviroment,ESD3 cells can developed into plasma cells.cytokines were not needed in the early development of ESD3 cells,conditional medium of the first stage of liquid culture could accelerate them to develop into hematopoietic cells,and the

8、 primary bone marrow stromal cells play a main role in the induction of plasma cells.MeSHEmbryo;Stem cells;Cytokines;Hematopoietic stem cells;Plasma cells胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)是从早期胚胎细胞分离的，能在体外长期培养的，高度未分化的细胞。胚胎干细胞的建立，为人们在体内外研究胚胎及器官发育带来方便。体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体1，造血岛内主要是原始红细胞，可检测到克隆形成细胞(

9、colony forming cells，CFC)。有关ES细胞向B淋巴细胞发育的研究较少，Nisitani等将发育7 d的胚胎体的细胞移至ST2成纤维细胞上，可检测到有重组激活基因(RAG)的转录及DJ基因的重排2，Potocnik等在低氧的环境中使ES细胞发育，1520 d后也可检测到VDJ基因重排及B220的B淋巴祖细胞3，但以上两种方法均未检测到成熟B淋巴细胞和浆细胞。本实验采用分阶段诱导胚胎干细胞发育的方法，探讨骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对胚胎干细胞发育的影响，建立ESD3细胞在体外定向诱导分化为浆细胞的体系，为体外研究造血细胞发育奠定基础。材料与方法一、材料：1.ESD35由上海

10、细胞生物学研究所丛笑倩教授提供。2.免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。3.FITCconjugated rat anti-mouse CD34和PEconjugated rat anti-mouse CD38均购自美国Pharmingen公司。4.干细胞因子(stem cell factor,SCF)、白细胞介素3(interleukin 3,IL3)、白细胞介素6(interleukin 6,IL6)、红细胞生成素(erythropoietin,Epo)等造血刺激因子由麒麟医药公司提供。血小板生成素(thrombopoietin,TPO)由杭州九源基因工程有限公司提供。5.胎牛血清购自美国Hy

11、clone公司。6.昆明鼠由本校动物中心提供。二、方法：(一)细胞培养：1.ESD3细胞培养及原代胚胎成纤维细胞的制备见参考文献9。2.骨髓基质细胞饲养层的制备：取68周的昆明鼠，取其股骨，用1 mL注射器冲出骨髓，DMEM液离心洗涤2次，接种于50 cm2的塑料培养瓶内。使用前用丝裂霉素C处理1 h，传入24孔塑料培养板内，加培养液备用。3.胚胎细胞条件培养液(conditional medium)的制备：使5×107L ESD3细胞在IMDM(Iscove' modified dulbecco's medium)液中培养，加入15%FCS，2ME(105 mol/

12、L)，3 d收集培养液，离心取上清，0.22 m滤膜过滤后备用。(二)分阶段诱导ESD3细胞发育为浆细胞：1.第一阶段：将1×107L ESD3细胞培养于含15%FCS，0.9%甲基纤维素的IMDM液内(6孔板)，分5组(表1)，每组设3个孔，分别加入巯基乙醇(105mol/L)、SCF(50 g/L)、Epo(4×103 U/L)、TPO(100 g/L)、IL3（50 g/L)、IL6（50 g/L)和胚胎细胞条件培养液(25%)，4 d在倒置显微镜下观察。实验重复3次。2.第二阶段：用PBS液吸打第一阶段培养形成的胚胎体(见表1第4组)，离心沉淀，胰蛋白酶消化，吹打成

13、单个细胞，分为3组(表2)，分别加入SCF(50 g/L)、TPO(50 g/L)，条件培养液(25%)及2ME(105mol/L),以不同的细胞密度培养于六孔培养板中，发育34 d。3.第三阶段：离心沉淀上述细胞，以5×107L密度种植于骨髓基质细胞饲养层上，加入SCF(50 g/L)，IL6（50 g/L)，发育6 d后，收集细胞，分别做Wright's染色，流式细胞仪检测及免疫组化。免疫组化用DAB染色试剂盒，仅在标本上加入二抗(抗小鼠的多克隆抗体)孵育，余按试剂盒说明操作。结果一、胚胎体形成(见表1)：第1组出现大片细胞坏死，因坏死细胞过多，使培养液变得浑浊。本实验排

14、除了细胞污染及因细胞密度过大，缺乏营养而死亡的可能性(细胞密度均为1×104孔)。第2、第3组细胞生长缓慢，无胚胎体出现。第4组大部分细胞形成了胚胎体(1)。第5组条件培养液并不能促进ESD3细胞向胚胎体的发育，且细胞状态不佳。表1细胞因子对ESD3细胞第一阶段发育的影响Tab 1Influence of cytokines on the developmentof ESD3 cells in the first stageGroupCytokinesResult(4 d of culture)1SCF，TPO，IL6，IL3，Epo，GCSFcells died2SCFgrew s

15、lowly,no formed embryoid body3IL6grew slowly,no formed embryoid body42MEformed embryoid bodies52ME，CM*?no formed embryoid body? *CM：conditional medium；2-ME：2-mercaptoethanol 表2细胞因子对第二阶段发育的影响Tab 2influence of cytokines on the developmentof ESD3 cells in the secondary stage Cytokines Result(4 d of sec

16、ondary culture)SCF，TPOgrew slowly SCF，TPO，2MEmost cells adherentedSCF，TPO，CMnon-adherented,formed colonies以下实验第一阶段均采用第4组体系。二、胚胎细胞向造血细胞分化：第二阶段(表2)，仅加入SCF和TPO，细胞增殖缓慢；2ME可使其增殖速度加快，但大部分细胞贴壁， Fig 1Embryoid body for 3 day of differentiation(×200)1发育3 d的胚胎体Fig 2Wright's stained plasma cell(×1

17、000）2浆细胞Fig 3Flow cytometry analysis of CD34 expression on cells for developing 6 days3流式细胞仪检测发育6 d的细胞的CD34抗原呈内皮细胞样细胞生长；若加入条件培养液，大部分细胞可形成细胞集落，收集此组发育至第6 d的细胞，流式细胞仪结果显示：86%的细胞呈CD34(3)。三、发育为浆细胞：将第3组发育至第7 d的细胞种植于骨髓基质细胞饲养层上，细胞由小变大，增殖形成集落，收集发育至14 d的细胞，流式细胞仪检测，大部分细胞呈现CD34CD38(4)，Wright's染色后油镜下观察，80%细胞呈

18、现浆细胞形态，核偏离一边，跑浆丰富，核浆比例较小(2)。免疫球蛋白免疫组化实验结果显示胞浆呈现棕色，说明其胞浆内含有免疫球蛋白。Fig 4Flow cytometry analysis of CD34 and CD38expression on cells for developing 14 dyas4流式细胞仪检测发育14 d的细胞的CD34抗原和CD38抗原讨论文献报道直接将ES细胞置于骨髓成纤维细胞系，可发育为造血细胞5；或直接在含有甲基纤维素的培养基里培养，初始即加入细胞因子4，也可诱导ES细胞向造血系细胞分化。我们探讨了原代骨髓基质细胞饲养层及细胞因子对ESD3发育的影响，在ESD3

19、细胞发育早期阶段，加入细胞因子反而不利于其发育。ES细胞发育为造血细胞的不同阶段，需不同的微环境，因而本实验采取分阶段诱导ESD3细胞发育的方法，在ES细胞发育至一定阶段后，才加入细胞因子及移入骨髓基质细胞饲养层上，能高效、定向地诱导B淋巴细胞的发生。胚胎干细胞在早期发育不依赖细胞因子体外悬浮培养ES细胞，可形成富含造血岛的胚胎体，Doetschman等4证明了人脐带血(含IL6等)和Epo可显著增加造血岛形成。在ES细胞体外发育为造血细胞的体系中，何时及加入何种因子，使其向造血细胞发育的效率最高，值得探讨。本实验结果表明，早期胚胎体的形成并不依赖细胞因子。胚胎体细胞表面不表达各种细胞因子(S

20、CF除外)受体，可能是胚胎体形成不需要细胞因子的原因之一。Nakano等6在研究骨髓硬化症小鼠基质细胞对ESD3细胞分化的影响时，发现MCSF可抑制ESD3细胞向造血细胞分化，其机制不清楚。2ME可与培养液中的半胱氨酸以二硫键结合形成复合物，使半胱氨酸更易进入胞浆，形成充足的谷胱甘肽，因而可促进胚胎体的形成6。胚胎细胞的条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化SCF和TPO均可促进骨髓造血干细胞的增殖和存活，然而仅在这两种因子作用下，胚胎体细胞发育缓慢。条件培养液可促使胚胎体细胞增殖形成CD34非贴壁生长的集落，细胞形态较小，类似早期造血细胞，表明条件培养液可促使胚胎体细胞向造血细胞分化。Ke

21、nnedy7等认为ES细胞来源的内皮细胞系的条件培养液(D4T CM，medium conditioned by an EB-derived endothelial cell line)可促进此阶段细胞的生长，此报道与本实验结果相符。骨髓基质细胞饲养层的作用骨髓内的造血微环境对造血细胞尤其是B淋巴细胞发育起重要作用。原代骨髓基质细胞饲养层接近体内的骨髓造血微环境，它对ESD3细胞分化的影响未见文献报道。本实验先使ESD3细胞在体外发育至CD34的细胞，再移至骨髓基质细胞饲养层，其可向CD34CD38的浆细胞分化。骨髓基质细胞饲养层分泌IL7、SCF等造血调节因子，另外其细胞表面的粘附因子VCA

22、M1（vascular cell adhesion molecular-1)与造血细胞表面的极晚期抗原4（very late activation antigen,VLA4）相互作用，均对B淋巴细胞的发育起重要作用8。诱导浆细胞现出的因素经抗原刺激后，成熟的B淋巴细胞才能转变为抗体分泌细胞即浆细胞。在本实验内，ESD3细胞来源于129品系的小鼠，骨髓基质细胞饲养层来源于昆明鼠，存在着抗原差异，可能是刺激B淋巴细胞向浆细胞分化的因素之一，在第三阶段的发育过程中，使用IL6因子，它是诱导B淋巴细胞向浆细胞分化的主要因子。*国家自然科学基金资助；博士点基金资助；CMB基金资助作者单位：乔春平李树浓梁

23、晓燕张秀明中山医科大学病理生理教研室(广州510089)黄绍良徐令孙逸仙纪念医院儿科参考文献1Mcclanahan T,Dalrymple S,Barkett,et al.Hematopoietic growth factor receptor genes as markers of lineage commitment during in vitro development of hematopoietic cells.Blood,1993,6:909.2Nisitani S,Tsubata T,Honjo T.Lineage marker-negative lymphocyte precu

24、rsors derived from embryonic stem cells in vitro differentiate into mature lymphocytes in vivo. Int Immunol,1993,6:909.3Potocnik AT,Nidlsen PJ,Eichman K.In vitro generation of lymphoid precursors from embryonic stem cells.EMBO J, 1994,13:5274.4Doetschman TC,Eistetter H,Kemler R,et al.The in vitro developm