survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用

1、survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对多西他赛的增敏作用         10-11-01 09:07:00     作者：刘超侠 董薇 孔庆兖    编辑：studa20【摘要】  目的 探讨生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)对人胃癌细胞株SGC7901的凋亡诱导、对多西他赛的化疗增敏作用。方法 设计合成特异性靶向survivin ASODN。

2、将胃癌细胞株分为空白对照组(Sham组)、单纯脂质体对照组(Lip组)、正义寡核苷酸转染对照组(Lip-SODN组)、ASODN转染组(Lip-ASODN组)。转染48 h后，Western blot法检测各组细胞survivin表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,MTT法检测转染细胞对多西他赛的敏感性。结果 脂质体介导survivin ASODN转染后的胃癌细胞survivin蛋白表达明显下降，细胞凋亡率明显高于各对照组(P<0.05)，对多西他赛的IC50值明显低于各对照组(P<0.05)，细胞生长抑制率明显高于各对照组(P<0.05)。结论 survivin ASO

3、DN转染胃癌细胞能下调survivin蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞增殖,增强多西他赛化疗敏感性。 【关键词】  生存素;反义寡核苷酸;胃癌细胞;凋亡;多西他赛;增敏作用Abstract:Objective To investigate the effects of survivin antisense oligonucleotide (ASODN) on the apoptosis and chemosensitivity to docetaxel of the human gastric carcinoma cell line SGC7901. Methods ASODN

4、targeting survivin was designed and constructed. The cultured gastric carcinoma cells were divided into the sham group, lipofectin group, sense oligonucleotide (SODN) group and antisense oligonucleotide (ASODN) group. After transfection for 48 h, the expression level of survivin in each group was de

5、tected by Western blot; the apoptotic rate (AR) was examined by flow cytometry; and the sensitivity of SGC7901 cells to docetaxel was determined by MTT.Results The expression of survivin in SGC7901 cells was downregulated after transfection with survivin ASODN; The AR of ASODN group was significantl

6、y higher than that of the other groups (P<0.05); IC50 of the transfected cells to docetaxel had a significant difference as compared to other groups (P<0.05), and the inhibitory rate (IR) of ASODN group was significantly higher than that of other groups (P<0.05).Conclusion The ASODN transfe

7、ction of gastric carcinoma cells can downregulate the survivin expression, induce cell apoptosis, inhibit cell proliferation and enhance the cell sensitivity to docetaxel, which may help to reverse drug resistance.Key words： survivin; antisense oligonucleotide; gastric tumor cell; apoptosis; docetax

8、el; chemosensitivity生存素(survivin)属于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的新成员，它可以通过有丝分裂促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，survivin在调节肿瘤细胞凋亡敏感性方面起着核心作用。本实验采用脂质体介导survivin反义寡核苷酸( survivin ASODN )转染人胃癌细胞SGC7901，以封闭survivin基因的表达，观察其对胃癌细胞SGC7901的凋亡诱导以及对化疗药物多西他赛的化疗增敏作用。1 材料和方法1.1 材料 胃癌细胞株SGC7901购于

9、中国科学院细胞生物研究所。survivin反义寡核苷酸、错配寡核苷酸(与反义寡核苷酸相同碱基组成、不同排列顺序)由上海生工生物工程公司合成，两端3个碱基经硫代修饰以对抗核酸酶的降解;反义寡核苷酸为5-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3，错配寡核苷酸为5-GCC ACT CCT CGA CTC TCG TC-3。阳离子脂质体Lipofectin购于Invitrogen公司。survivin抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的第二抗体购于Santa Cruz公司，RPMI 1640 购于Invitriogen公司，小牛血清购于杭州四季青公司，多西他赛购于Aventis Pha

10、rma Dagenham公司。1.2 方法1.2.1 细胞株培养 人胃癌细胞株SGC7901用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，在37、5%CO2的饱和湿度条件下培养。1.2.2 细胞分组及转染 取对数生长期的SGC7901，传代接种于6孔培养板内，调整细胞密度，使每孔的细胞数为3×105，常规条件下培养24 h，显微镜下观察，约80%细胞融合时开始实验。设置空白对照组(Sham组)、单纯脂质体对照组(Lip组)、正义寡核苷酸转染对照组(Lip-SODN组)和反义寡核苷酸转染组(Lip-ASODN组)，每组设3个复孔。细胞转染过程按转染试剂盒说明书进行，转染12、24、48

11、 h后收集各组细胞用于后续实验。1.2.3 Western blot法检测细胞survivin蛋白表达 将预冷至4的匀浆缓冲液加入到经HBSS漂洗的培养细胞中,冰上刮取细胞，收集，冰浴中超声破碎(10 s×3)，测定蛋白浓度,以100 g/孔上样,15% SDS-PAGE凝胶电泳分离,通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜置封闭液中室温孵育3 h后,加入一抗(兔抗人生存素抗体,工作浓度为1500)4孵育过夜,TBST充分漂洗(5 min×3次),加入HRP标记的二抗(羊抗兔IgG-AP,工作浓度为1500)37作用2 h,TBST充分漂

12、洗(5 min×3次),以NBT/BCIP显色,观察结果。1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将收获的各组细胞制成单细胞悬液,加入预冷的70%冰乙醇,-20内固定24 h,加RNA酶(终浓度为50 mg/L)37反应1 h，再加入碘化丙啶溶液(质量浓度100 mg/L)避光染色30 min后，在流式细胞仪上检测,应用相应程序软件进行资料的处理和分析。1.2.5 MTT 法检测各组细胞对多西他赛的敏感性 收获的各组细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640重悬,倒置显微镜计数细胞,调整细胞密度为1×105/L,并接种于96孔板内,每组设置7个复孔，其中1孔作调零用(空白对照

13、组)，另6孔依次加入0、1、10、20、50、100 g/L的多西他赛，再各设6个复孔。常规条件下培养48 h,每孔加入5 g/L的MTT 20 l,继续培养4 h,倾尽上清。每孔加入二甲基亚砜0.1 ml,摇床上摇动约15 min以充分溶解,用酶标仪在波长570 nm处检测各孔光密度值(D值),计算细胞生长抑制率(IR)=(1-实验组平均D值)/空白对照组平均D值×100%。1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0软件进行数据处理，应用方差分析、q检验行差异显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 ASODN转染后SGC7901细胞survivin蛋白表

14、达变化 ASODN转染组survivin蛋白表达下调,与各对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);各对照组survivin蛋白表达无明显改变，各对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。与其他组比较：#P<0.052.2 ASODN转染对细胞凋亡率的影响 ASODN转染可诱导SGC7901细胞凋亡, ASODN作用48 h的胃癌细胞，在G1期前出现亚二倍体凋亡峰，对照组未见凋亡峰。ASODN转染组细胞凋亡率明显高于其他组(P<0.05),而各对照组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图2。2.3 ASODN转染后胃癌细胞对多西他赛敏感性的检测 各组细胞随多西他赛药物浓度提高，细胞生长抑制率均呈上升趋势，但ASODN转染的SGC7901细胞生长抑制率明显高于其他各对照组(P<0.05)，Sham、Lip 和 Lip-SODN 对照组间差异无统计学意义(P&