β射线诱导成纤维细胞凋亡与防治瘢痕增生的关系

1、    射线诱导成纤维细胞凋亡与防治瘢痕增生的关系        【摘要】目的探讨射线防治瘢痕增生的作用机理。方法用MTT法分析射线对增生性瘢痕成纤维细胞生长的影响；用电镜、DNA凝胶电泳和流式细胞仪观察细胞形态和DNA的变化。结果射线明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的生长；10Gy 射线诱导出典型的细胞凋亡特征，如凋亡小体、DNA梯状条带、特征性亚G1峰等，20Gy 射线导致细胞坏死。结论射线诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡是放射防治瘢痕增生的重要机理之一，射线诱导细胞凋亡与照射剂

2、量密切相关。【关键词】射线细胞凋亡瘢痕成纤维细胞The role of -ray induced fibroblasts apoptosis on the inhibition of hypertrophic scarWANG Xuehong,LUO Jinhui(Department of Plastic Surgery,Nangfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515,PR China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of -ray indu

3、ced apoptosis of the fibroblasts on the inhibition of hypertrophic scar.Methods A series of patients with hypertrophic scar were grouply treated with a certain dose -ray.A liopic sample was taken in each patients.Its was then examined with MTT3-(4,5-dimethylthiazol.-2-yl)-2,5-dipheny1 terazolium-bro

4、midetechinque for deciding the inhibition rate of the fibroblasts,with electron microscope technigque,DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry for evaluating the morphological and biochermical characteristics of the fibroblast.Results The -ray radiation resulted in significant inhibition o

5、f the fibroblast.The features of fibroblast apoptosis(e.g:apoptic bodies,DNA ladders band and hypodiploid DNA peak)could be seen in the group with lower does (10Gy).The features of fibroblast necrosis could also be found in the group with higher does(20Gy).ConclusionsThe -ray radiation could have th

6、e effect for inhibiting the proliferation of scar-derived fibroblast,but with dose dependence.It could be used for the treatment and(or)the prevention of hypertrophic scar.【Key words】-ray rediation;Apoptosis;Scar;Fibroblasts辐射治疗瘢痕增生已有几十年的历史，因射线的穿透力弱，通过调节能量可控制其穿透深度，不易引起深部正常组织的不良效应，经临床实践表明，射线防治瘢痕增生确有较

7、好的疗效，且副作用少1，因此，研究射线防治瘢痕增生的作用机理具有重要的临床意义。我们采用离体培养的增生性瘢痕成纤维细胞探讨了射线杀伤细胞的作用机理。1材料与方法1.1成纤维细胞培养将手术切除的增生性瘢痕组织采用组织块贴壁法2，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在5%CO2、37、饱和湿度和95%空气中进行原代培养。待细胞生长成片后，用0.25%胰蛋白酶消化传代，继续培养。取第5至第15代指数生长期细胞进行实验。1.2射线对成纤维细胞生长影响的观察将培养瓶中细胞消化后形成细胞悬液，采用血细胞计数法计数细胞，按105/ml细胞数分装到2ml塑料冻存管中，分别设置对照组和两个不同照射剂量组。根据直

8、线加速器剂量公式将吸收剂量(Gy)换算成机器处方剂量(Mu值，表1)3。照射条件：采用医用直线加速器发射的6Mev 射线等距离照射，剂量率为320Mu/min(Gy=100Mu)，照射野20cm×20cm，照射深度1.2cm(加0.5cm有机玻璃)。对照组除不照射外，其余处理因素同照射组。照射完毕后，将冻存管中细胞种回培养瓶、96孔板，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，在培养箱中培养，每隔2d换液1次。表1照射分组和剂量换算表Tab 1Groups of radiation and conversion of doses编号吸收剂量(Gy)处方剂量(Mu)照射时间(min)100

9、021010173.1232020346.361.2.1细胞生长曲线和生长抑制率的测定采用改良MTT3-(4,5-二甲基三噻唑-2-y1)-2，5-二甲基-四唑溴盐测定法4，取对数生长期细胞，射线处理后，按5×103细胞/孔接种于96孔培养板内，每孔加入含10%胎牛血清的培养液200l，分别按照对照组和处理组细胞，各种4个板，每组各以5个孔作为复本，分别在培养后12，24，48，72h，用全自动酶标仪测定各孔的吸光度A值，测定波长570nm，参考波长为630nm，酶标仪所示值为A570减去A630的值。取各组的平均A值描绘细胞生长曲线。根据下列公式计算细胞生长抑制率：抑制率(%)=(

10、对照组A值-处理组A值)/(对照组A值)×100%1.2.2细胞超微结构观察收集细胞悬液于事先制备好的琼脂管中，2 000r/min离心，使细胞成团，弃上清，加入2%戊二醛固定，4保存30min后，将琼脂管内细胞团块剥出，用1%锇酸固定12h。按电镜常规法制备超薄切片，透射电镜下观察超微结构的变化。1.2.3DNA琼脂糖凝胶电泳收集细胞，PBS洗2次，离心5min(3 000r/min)，在细胞沉淀中加入500l DNA提取液悬浮，55水浴消化过夜，酚、氯仿：异戊醇抽提后，2倍体积无水乙醇沉淀DNA，TE：RNase(1ml:1l)37水浴溶解DNA 4h，将样品与上样缓冲液混合(1

11、2)，以1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行分离5，溴化乙锭染色后，紫外灯下观察DNA电泳谱。1.2.4流式细胞仪分析6将对照组与处理组细胞悬液分别接种于50ml培养瓶，孵育1248h，分别将贴壁细胞用酶消化后，收集对照组与10Gy照射组1248h后细胞制成单细胞悬液(106细胞/ml)；PBS清洗，8001 000r/min离心5min，共2次；用70%乙醇固定细胞(至少固定18h)，4保存。染色前用PBS进行离心沉淀去除固定液；加入500l PI染色液(含PI 100g/ml,RNase 500g/ml)，37避光孵育30min。上机测试，激发波长为488nm。2结果2.1细胞生长曲线瘢痕成纤维细

12、胞经过不同剂量射线照射后，细胞的生长趋势随照射剂量的不同各有差异，10Gy照射的细胞生长趋势与对照组基本一致，但经过照射的细胞生长缓慢。20Gy照射的细胞生长趋势与对照组相比差异较大，细胞生长曲线低平(1)。1射线照射前后瘢痕成纤维细胞的生长曲线Fig 1The growth curves of fibroblasts before and after -ray radiation2.2细胞生长抑制率瘢痕成纤维细胞经不同剂量射线照射后，细胞的生长抑制率随着照射剂量的升高而增加(P0.01)；照射后48h的抑制率明显高于24h(P0.01，2)。2不同剂量射线照射后瘢痕成纤维细胞的抑制率Fig

13、2The inhibition rates of fibroblasts after -ray radiation with different doses2.3射线对细胞超微结构的影响透射电镜观察对照组细胞核大，核质均匀细致，胞浆内有丰富粗面内质网和线粒体(3)。10Gy处理组可见细胞凋亡的特征性形态学变化：细胞核缩小，染色质凝集，细胞表面形成许多球形突起(起泡)，突起内见被包裹的胞质与细胞器、核的碎片或整个浓缩的细胞核，部分突起与细胞脱离，形成凋亡小体(apoptotic bodies)；凋亡小体自细胞一端开始出现，小体内细胞器结构仍完整；细胞崩解成多个有膜包绕的圆形凋亡小体，有的细胞凋亡

14、小体被邻近细胞吞噬(4，5)。20Gy处理组细胞肿胀，早期胞膜、核膜仍保持其完整形态，胞浆内出现较多空泡，内质网数量减少，线粒体肿胀、裂解或空泡化，晚期细胞质膜破坏，核溶解，细胞内容物释出(6)。2.4DNA琼脂糖凝胶电泳瘢痕成纤维细胞经射线照射，10Gy照射后48h处理组的DNA电泳呈现典型的有一定间隔的细胞凋亡梯状条带(ladder's band)，20Gy处理组DNA则呈无间隔的涂片状带(Smear's band)，对照组仅在近电泳点样处出现基因组条带(7)。A对照组基因条带B10Gy处理组梯状条带C20Gy处理组涂片状带MMarkers带7成纤维细胞DNA电泳结果A.C

15、ontrolB.Ladder's band 48h after radiation with 10GyC.Smear's band 24h after radiation with 20GyM.Molecular weight markersFig 7Agarose gel electrophoresis of DNA extracted from fibroblasts2.5流式细胞仪分析用10Gy 射线照射瘢痕成纤维细胞，对照射前后不同时间(12，24，48h)的细胞凋亡进行检测，照射前、照射后12h细胞凋亡率为0，照射后24，48h细胞凋亡率分别为14.7%、47.1%，

16、并在DNA直方上出现典型的凋亡细胞峰(亚G1峰，8)。3讨论我们的研究结果表明，射线能抑制体外增生性瘢痕成纤维细胞的生长，并且有一定的杀伤效应。通过透射电镜观察，10Gy 射线照射后的瘢痕成纤维细胞形态出现细胞凋亡的两个阶段变化：一是细胞体积变小，胞核与胞浆浓缩，核裂解，细胞表面起泡，有凋亡小体形成；二是凋亡小体被周围细胞吞噬、消化、降解。而20Gy 射线照射后的细胞出现水肿，体积变大，细胞质膜破裂，核溶解，细胞内容物释出等细胞坏死的改变。从形态上证实射线在低剂量时能引起瘢痕成纤维细胞凋亡。DNA琼脂糖凝胶电泳出现有一定间隔的梯状条带(ladder's band)和流式细胞仪检测到特征

17、性亚G-1峰是目前判断细胞凋亡的重要指标4，8。我们的研究结果表明，瘢痕成纤维细胞经过不同剂量射线照射后，10Gy组电泳呈典型梯状带，20Gy组呈无间隔的涂片状带(Smear's band)；且流式细胞仪可检测到10Gy组有特征性亚G1峰出现。从而进一步证实了射线在低剂量可诱导瘢痕成纤维细胞凋亡。8照射前(上)和10Gy 射线照射后24h(中)、48h(下)的成纤维细胞DNA直方，可见照射后出现特征性亚G1峰()Fig 8DNA fluorescence flow cytometric profiles of P I-stained fibroblasts before radiati

18、on(Up),24h(Middle)and 48h(Down)after radiation with 10Gy showing typical hypodiploid DNA peak()after radiationKalassen等9认为，凋亡是一个需要基因表达、蛋白质合成和能量的主动过程，照射剂量超过10Gy足以破坏基因转录或直接破坏膜的完整性，使细胞不能维持膜内外离子梯度，故凋亡的途径不能被启动。我们的研究结果也证实，高剂量照射致细胞死亡是一个被动过程，不具备凋亡的特征性变化。在同一系细胞群体中，触发细胞凋亡的剂量远远低于造成细胞快速坏死所需要的剂量。凋亡与坏死在治疗上的意义是不同的

19、，坏死是细胞水肿、破裂，溶酶体酶释放而引起邻近细胞受损，局部炎症反应出现，而炎症反应是瘢痕过度增生的主要原因之一。凋亡是一种“干净”的细胞清除过程，凋亡细胞通过形成凋亡小体而被邻近细胞吞噬、消化、溶解，不引起局部炎症反应。因此，低剂量射线照射诱导细胞凋亡是放射治疗瘢痕增生的理想选择。近几年来，国外文献报道的有关辐射诱导细胞凋亡出现的时间因组织细胞类型的不同而各有差异，且体内细胞凋亡出现快，高峰出现较早，体外培养细胞凋亡出现较晚10-12，但尚无成纤维细胞凋亡出现时间的研究。我们的实验结果显示，体外瘢痕成纤维细胞经射线照射后，凋亡出现于24h，48h的细胞凋亡率明显高于24h。综上所述，射线诱导

20、瘢痕成纤维细胞凋亡是其防治瘢痕增生的重要机理之一，射线所致的细胞凋亡与照射剂量密切相关。这一结果为临床应用射线防治瘢痕增生提供了一定的实验基础和理论依据。3照射前成纤维细胞电镜，细胞结构完整、核质均匀细致(，×5 000）Fig 3Electron micrograph of fibroblasts before radiation,showing integrated cell structure and uniformly|distributed chromation(×5 000）410Gy 射线照射后24h成纤维细胞电镜，呈典型的凋亡细胞形态变化（×5 0

21、00），凋亡细胞表面“起泡”()，部分泡脱落形成凋亡小体()Fig 4Electrom micrograph of fibroblasts 24h after radiation with 10Gy,showing typical apoptotic morphologica changes（×5 000），Blisters on the surface of apoptosis(),the dropped blister is forming apoptotic bodys() 510Gy 射线照射后24 h凋亡细胞崩解成多个凋亡小体()Fig 5Apoptosis explode

22、d into many apoptotic bodys()620Gy 射线照射后24h成纤维细胞电镜，细胞质膜破裂，核溶解()，细胞内容物释出Fig 6Electron micrograph of fibroblasts 24h after radiation with 20Gy,showing broken cell|membrane,dissolved nucleus(),released content of cell作者单位：王雪红(第一军医大学南方医院整形外科广州，510515)罗锦辉(第一军医大学南方医院整形外科广州，510515)参考文献1，郑茂锭.瘢痕疙瘩术后射线放射治疗：52

23、例疗效随访观察.临床皮肤科杂志，1988，182-184.2，Diegelmann RF,Cohen IK,Mccoy BJ.Growth kinetics and collagen synthesis of normal skin,normal scar and keloid fibroblasts in vitro.J Cell Physiol,1979,98:341-346.3，谷铣之，殷蔚伯，刘泰福，等.肿瘤放射治疗学.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993：136.4，姜泊，张亚历，周殿元，等.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996：170-183.5，Sambrook EJ,Fritsch F,Maniatis T.Molecular cloning.2nd ed.Cole spring Harbor Laboratory,press 198.7.分子克隆实验指南.余冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1993：102.6，Nicoletti I，Migliorati G,Pagliacci MC,et al.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodi