非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究

1、非霍奇金淋巴瘤BCL-XL基因表达及突变的研究         08-03-07 16:43:00     编辑：studa20       作者：刘元华, Christophe Leboeuf, 金晓龙,肖家诚, Anne Janin, 陈赛娟，赵维莅【摘要】  本研究探讨78例非霍奇金淋巴瘤BCL-XL表达和突变的发生率及其临床意义。应用激光微切割技术从淋巴结组织中特异地分离淋巴瘤细胞，用实时定量RT-

2、PCR法检测淋巴瘤组织和淋巴瘤细胞中BCL-XL的表达，PCR直接测序法检测BCL-XL的突变情况。结果表明：与淋巴结反应性增生（15例）相比，滤泡性淋巴瘤（30例）组织和微切割的淋巴瘤细胞均高表达BCL-XL（P值分别为0.0064和<0.0001），而T细胞淋巴瘤（24例）和弥漫性大B细胞淋巴瘤（24例）中BCL-XL表达无明显升高。在滤泡性淋巴瘤中，BCL-XL高表达的患者常伴多个淋巴结外器官累及（P=0.0004），血清乳酸脱氢酶水平升高（P=0.0019），国际预后指数分组多为高危组（P=0.0013），患者总生存期短（P=0.0451）。突变检测发现1例滤泡性淋巴瘤BCL-X

3、L的同义突变（密码子 109 ACAACC）。结论：BCL-XL表达与滤泡性淋巴瘤的疾病进展和患者预后密切相关。 【关键词】  非霍奇金淋巴瘤；BCL-XL基因；基因表达；基因突变BCL-XL Expression and Mutation in Non-Hodgkins LymphomaAbstractThe study was aimed  to investigate the BCL-XL expression and mutation, and   its clinical significance in non-Hodgkins lymphom

4、a. Lymphoma cells were selectively isolated by laser microdissection. BCL-XL expression from lymphoma tissue and microdissected lymphoma cells was measured by using real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. BCL-XL mutation was analyzed by using direct sequencing of PCR

5、products. The results showed that  compared to 15 patients with reactive hyperplasia, BCL-XL was overexpressed in follicular lymphoma (n=30), both in lymphoma tissue (P=0.0064) and in microdissected lymphoma cells (P<0.0001). No significant rise of BCL-XL expression was observed in patients

6、with T-cell lymphoma (n=24) and diffuse large B cell lymphoma (n=24). In follicular lymphoma, high BCL-XL level was associated with multiple extranodal involvement (P=0.0004), elevated lactate dehydrogenase level (P=0.0019), high-risk international prognostic index (P=0.0013) and a short overall sur

7、vival time (P=0.0451). Mutation analysis revealed one synonymous mutation (Codon 109 ACAACC) in one case of follicular lymphoma patient. It is concluded that BCL-XL expression is closely correlated with progress of follicular lymphoma and prognosis of patients with follicular lymphoma. The value of

8、BCL-XL expression as a prognostic marker in follicular lymphoma should  be considered.Key wordsNon-Hodgkins lymphoma; BCL-XL gene;  gene expression;   gene mutation淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。近20年来，非霍奇金淋巴瘤在世界范围内的发病率几乎增长了1倍，严重危害人类的健康1。 因而探索淋巴瘤的发病机制、掌握淋巴瘤的疾病进展相关基因，对于淋巴瘤的诊断治

9、疗前景，特别是开展个体化诊治和基因靶向治疗具有重要意义。凋亡异常对于恶性肿瘤的发生发展起着相当关键的作用。 凋亡受阻致使肿瘤细胞寿命延长， 异常堆积，最终引起细胞转化和肿瘤形成2。 同时，诱导凋亡又是肿瘤治疗，包括化疗药物治疗、放射治疗和免疫治疗的重要机制之一。凋亡抑制可使肿瘤细胞产生耐药，导致治疗失败或疾病复发3。细胞凋亡主要通过两个途径：外源性途径和内源性途径。后者起始于线粒体细胞色素C的释放，作用于凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease-activating factor-1，Apaf-1），诱导caspase-9活化，导致细胞凋亡2。BCL-2家族在调节凋亡的内源性途

10、径中起着重要作用，按其功能不同主要分为两类：一类是促凋亡蛋白，包括BAX、BAK、BOK、BCL-XS、BID、BAD等，另一类是抗凋亡蛋白，包括BCL-2、BCL-XL、BCL-W、MCL-1、A1等4。 在非霍奇金淋巴瘤中，内源性途径受抑也是影响肿瘤细胞凋亡的重要因素5。BCL-XL是BCL-2家族的主要凋亡抑制因子，由BCL-X编码，后者位于20q11.21，由3个外显子组成。BCL-X缺陷的小鼠表现为幼稚淋巴细胞的凋亡明显增加，同时亦证实BCL-XL在淋巴瘤中表达6，7。然而，它在不同类型淋巴瘤中的表达情况和与疾病进展的关系尚缺乏系统的研究。本研究应用实时定量RT-PCR法检测78例患

11、者淋巴瘤组织和细胞中BCL-XL的表达，应用PCR直接测序法检测是否存在BCL-XL突变，探讨BCL-XL的表达及基因突变在淋巴瘤发生发展中的意义。材料和方法患者患者共78例, 来自上海交通大学医学院附属瑞金医院和法国巴黎第七大学圣路易医院，其中男38例，女40例，年龄21-88岁，中位年龄52岁。按WHO病理分型，78例中T细胞淋巴瘤24例，弥漫性大B细胞淋巴瘤24例，滤泡性淋巴瘤30例。对照组为淋巴结反应性增生患者，共15例。两组均经患者知情同意后，留取部分淋巴结活检组织，-80冻存，用于提取DNA和RNA。另有60例健康志愿者，采集其外周血，提取DNA，作为基因突变检测对照。激光微切割用

12、淋巴结冷冻组织制备7 m切片，70%酒精固定，苏木素-伊红染色。应用激光微切割仪（LEICA公司产品）切割约1 500个淋巴瘤细胞，自动置入TRIzoL中，用于RNA提取。DNA提取按常规酚-氯仿抽提，冷无水乙醇沉淀法提取基因组DNA8，最后溶于适量TE中。紫外分光光度计测定样品DNA含量。RNA提取淋巴结组织总RNA经制备10-15片10 m冰冻组织切片后提取，淋巴瘤细胞总RNA直接从激光微切割的细胞中提取，操作参照TRIzoL试剂盒说明书进行。cDNA合成通过逆转录反应将RNA 转化为cDNA。25 l逆转录体系包括： 5×逆转录缓冲液5 l；dNTP 5 l；Oligo-dT

13、2 l；逆转录酶MMLV(Promega公司产品) 1 l；RNasin 0.5 l，淋巴结组织模板为1 g总RNA，激光微切割的淋巴瘤细胞模板为所有微切割产物提取的总RNA产物。反应条件：42 60分钟，90 5分钟，4保存。实时定量PCRBCL-XL和TBP（human transcription factor IID/TATA binding protein）的TaqMan定量PCR试剂购自PEApplied Biosystems公司，通过ABI PRISM 7700定量PCR仪检测。TBP作为内参校正样本量，同时将表达BCL-XL的Jurkat细胞系9作对照。定量PCR结果参照2(-C

14、T)法计算10，所示数值为每个标本BCL-XL表达量和Jurkat细胞BCL-XL表达量的比值。PCR直接测序采用Taq酶（购自申友公司）通过PCR法扩增BCL-XL各目的片段。PCR 反应体系为25l。扩增条件：预变性94 5分钟；循环条件为94变性30秒, 退火温度为54-60（根据各引物不同而改变）, 退火时间为30秒，72延伸50秒，共35个循环；72 7分钟。扩增启动子区与外显子的引物序列如下：启动子区上游引物：5 TGCGGGGATGCCGGTAACTC 3；下游引物：5 GCCTCACCCTCACCCAGTCT 3 ；1号外显子上游引物：5 TAATAGGGATGGGCTCA ACC 3；下游引物：5 CTTCGCAATTCCTGTGT CGC 3；2号外显子上游引物：5 AAGAAAAGGGA CACACAAGG 3；下游引物：5 TGAGTGAGCAG GTGTTTTGG 3；3号外显子上游引物：5  ATACCT GCCAGCCTCCTTTG 3；下游引物：5 TTTCCCC ACCCACCTACATC 3。PCR产物纯化测序采用虾碱酶（shrimp alkaline