课程论文-葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆

1、青岛农业大学 本 科 生 课 程 论 文题 目: 葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆 姓 名: 刘丽雪 学 院: 生命科学学院 专 业： 生物技术 班 级： 2007级4班 学 号： 20072833 指导教师： 薛仁镐 完成时间： 2010.8.15 2010年8月20日葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆生物技术 刘丽雪指导教师 薛仁镐摘要：本文以葡萄幼苗为材料，依据基因组序列，设计引物，以基因组DNA为模板，利用PCR技术，对葡萄逆境胁迫诱导型启动子进行了扩增，获得了约1.4 kb的启动子序列，将启动子片段回收后连接到T载体，经酶切鉴定结果表明，所需启动子成功构建到T-A载体。葡萄逆境胁

2、迫诱导型启动子的克隆对下一步抗逆调控分子机制研究及作物分子育种具有重要理论和实际意义。关键词：逆境胁迫；启动子；PCR扩增；克隆Cloning of Adversity Stress Promoter in GrapesStudent majoring in Biotechnology Liu lixue Tutor Name Xue Ren-GaoAbstract: The promoter of gene was amplified by PCR technology using genomic DNA of grapes as template in this study. The 1.

3、4 kb fragment of promoter was then ligated to the T cloning vector and confirmed by digestion with endonuclease and sequencing. Cloning of adversity stress promoter has important significance on molecular regulation mechanism of adversity and genetic breeding in crop.Key words: Stress tolerance；prom

4、oter；PCR amplification；Cloning 1. 引言葡萄（Vitis vinifera L.）在植物学分类中属于葡萄科(Vitaceae Lindley 或 Ampelideae Kunih)葡萄属(Vitis L.)的藤本浆果。葡萄科中有12个属，约600个种1。葡萄是最古老的被子植物之一，起源于欧、亚大陆和北美洲的连片地区。主要栽培类型则起源于中亚西亚一带，主要分布于世界的温带、亚热带、热带地区，主要野生于森林、山坡或河谷等地。葡萄科中只有葡萄属有较高的经济价值，并且得到广泛的栽培和较深入的研究。葡萄是一种营养价值较高的浆果，素有水果皇后的美誉，广泛应用于我们的日常生活

5、中，它不但营养丰富、用途广泛：色美、气香，味可口，是果中佳品，既可鲜食又可加工成各种产品，如葡萄酒、葡萄汁、葡萄干等，而且果实、根、叶皆可入药，全身都是宝。是国际市场上重要的商品。启动子决定着基因时空表达的特异性，目前通常采用分子生物学手段对生物反应器进行遗传改良，希望插入的外源目的基因能够限定在某一特定的组织或部位进行高效表达，在不影响该生物反应器其它特性的前提下，能够集中在靶组织方便地收集表达产物。植物启动子由核心元件和上游元件构成,如TATA-box和起始因子(initiator)。在逆境相关基因的启动子序列中还存在一些与逆境诱导相关，参与基因转录调控的顺式作用元件。目前研究较深入的有：

6、脱落酸响应元件 5-8、乙烯响应元件 6-8、茉莉酸类物质应答元件8、低温响应元件12和干旱应答元件3-6等。ABA诱导裘达基因启动子存在一个PyACGTGGC保守序列，该序列在小麦胚胎发生晚期表达基因E3中首次被确定为ABA应答元俘，核心序列为A/GCGT。拟南芥RD29B基因启动子中存在两个ABRE，只有遮两个元件相置作用，形成ABA应答复合体，才能指导核心启动子的ABA诱导活性2。由于信号测激雨具有转录活性的启动子称为诱导型启动子。该类启动子可以快速有效地诱。在逆境相关基因的启动子序列中还存在一些与逆境诱导相关，参与基因转录调控的顺式作用元件。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件与基因上游

7、启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子非生物胁迫，如导转录基因的“开、关”：可根据需要在植物特定发育阶段、组织器宫或生长环境下接受诱导蕾号，诱导基因表达；也可以随时解除胁迫，停止表达。非生物胁迫，如干旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。rd29A启动子能够驱动目的基因在干旱、低温和ABA等非生物胁迫下表达，

8、是目前抗逆植物熬因工程中虑用最广泛的诱导型启动子。Kasuga等7分别利用35S启动子和胁迫诱导型启动子rd29A驱动拟南芥DREBIA转化拟南芥，rd29A：DREBlA转基因植株的胁迫耐性明显高于35S：DREBIA的转基因植株；而且在胁迫诱导下，rd29A驱动的目标基因表达积累与胁迫诱导相关基因的表达在相同水平中，说明诱导型启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐的耐受性。冬麦bltl01基因启动子受低温诱导，在其转录起始位点上游-168到-275区段内存在一个高度保守的TCAlike元件(TCATCTTCTr)，Brown等首次发现该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。2

9、. 材料与方法2.1 材料菌种和载体：大肠杆菌DH5由本实验室提供，T载体购于TaKaRa公司。酶及化学试剂：各种限制性内切酶开,关、Hind、EcoR均购于TaKaRa公司。其他所需药品均为分析纯。开,关开,关2.2.1 引物序列的设计 利用已知的基因序列找到其逆境胁迫诱导型启动子的序列并由此设计引物，设计的引物如下：VVESTPF1 ACACTCGTCCCATCTCCCATCVVESTPR1 TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC2.2.2 组培培养葡萄幼苗 1/2MS生根培养基根据培养基配方，各种母液的浓度及要求配制的总量计算好需要各种母液的量，分别量取50 mL大量元素、10 m

10、L微量元素、10 mL铁盐、10 mL有机物、10 mL CaCl2等母液。加入30g/L蔗糖，加入IAA，1 mg/mL，用磁力搅拌器搅拌溶解后，定容。用1M NaOH或0.1M HCL调节pH值到5.8。加入琼脂，8g/L。分装，一般1L分为2426个培养瓶；封口。高压蒸汽灭菌。121下灭菌20 min。在超净工作台上把葡萄幼苗剪切带芽幼茎接到1/2MS生根培养基上进行培养，完成后放入恒温箱中保存，定期观察花生的生长情况，培养至幼茎生根发芽并发育成小苗，即可进行试验。2.2.3 基因组DNA的PCR扩增以提取的葡萄基因组DNA为模板，利用设计的简并引物进行PCR扩增，获得基因片段。混合液成

11、分 加入体积(50l)10×buffer(Mg2+) 5 LdNTP(2.5mM) 8 L引物1 (20M) 1 L引物2 (20M) 1 LTaq(5U/l) 0.5 LDNA/cDNA 12 LddH2O 22.5 L将混合好的液体均匀的分装到两个管中，每管25L.(2) 反应程序：各组分充分混匀后，在PCR仪上扩增。反应程序如下：94预变性5min94变性40s45-55退火40s 72延伸2min 完成30个循环72延伸10min在PCR仪上扩增。扩增结束后，向反应体系中加10L6×Loading buffe，混匀，取6L在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果。2.2

12、.4 琼脂糖凝胶电泳检测 制备凝胶：在锥形瓶中加入0.4g的琼脂糖和40mL的TAE缓冲液，充分溶解后，冷却后加入染料4L。电泳板安放好梳子后倒胶，注意倒胶时要慢慢倒，不能有气泡产生。室温下放置，直至凝胶完全凝固。 在有DNA的离心管里加入6×Loading buffer，混匀。将电泳板放入盛有缓冲液的电泳槽内。注意点样孔端在电源的负极。然后用移液枪进行点样，每孔点样8L。 于电压100V下电泳30-40 min。电泳结束后紫外灯上观察条带。2.2.5 基因片段的回收PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的基因片段用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。步骤为：层析柱的平衡：200L buff

13、er GPS，2支，室温放置3-5min，12000rpm，离心2min，加700L水，12000rpm离心2min。放置待用。 切下目的基因片段，放入离心管中，称量，按1g/mL加入Binding Buffer。55-60加热7min，中间混匀2-3次。将回收的溶液加入平衡的离心柱中，10000rpm离心1min。弃下层溶液，加入300L Binding Buffer，1000rpm离心1min。弃下层溶液，加入700L SPW washing buffer，10000rpm离心1min。重复一次。弃下层溶液， 13000rpm离心1min，离心柱。在管中加入40L Elution buff

14、er，室温放置10min，13000rpm离心1min。2.2.6 PCR扩增产物与T载体连接及连接产物转化一般DNA片段的克隆实验 配制DNA溶液，pmD19-T Vector 1L加Insert DNA4L。 加入等量的（5L）Solution。 4过夜连接 全量的（10L）加入至100LJM109感受态细胞中，冰中放置30min。 42加热90S后，再在冰中放置1min。 加入750L LB培养基，37振荡培养60分钟。 在超净工作台上抽取10L，在抗Amp培养基上涂板，之后37培养12个小时，放置待用。2.2.8 连接目的基因质粒的提取： 从制备的培养皿上挑连接目的基因的单菌落至15m

15、L LB培养基中，加入15L Amp ，37摇床培过夜。取摇床过夜的培养基至离心管中，10000rpm离心1min，根据菌量的多少提取适量的菌。 弃上清，加入250L Solution/RNaseA，混匀。 加入250L Solution，颠倒混匀，静置2min。 加入350L Solution，加入后快速混匀，静置5min，会出现白色沉淀。 12000rpm离心10min。用移液枪吸出上层溶液至层析管中，8000rpm离心2min。 加入700L DNA Wash Buffer洗涤，10000rpm离心1min，重复一次。 10000rpm离心2min，去除残液，37烘干5min。 转入新的

16、离心管中，加50L的Eolution Buffer，37静置5min，之后10000rpm离心。 电泳鉴定。3 结果与分析：3.1 PCR扩增图3-1 PCR产物的凝胶电泳分析启动子序列的预期大小为1354bp。以提取的基因组DNA为模板，PCR扩增目的启动子片段后，进行了琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，PCR扩增得到了约1400 bp大小的一条DNA片段，与预期的启动子大小一致（图3-1）。其中1列与2列为温度梯度比较，1列是在退火温度为58时的PCR结果，2列是退火温度为56时的结果，下边的浅色条带非特异性DNA 片段。3.2 质粒提取鉴定图3-2 左侧为Marker，右侧为提取连接目的基因

17、后的质粒电泳将PCR产物回收后，连接到T载体上。电泳结果表明目的DNA片段已与质粒连接。3.3 酶切鉴定和序列鉴定图3-3左侧为Marker，右侧为双酶切后电泳，最后为质粒将PCR产物回收后，连接到T-A载体，然后转化到大肠杆菌细胞，大量繁殖后，提取质粒DNA，用EcoRI和Hind双酶切进行了鉴定（图3-3）。结果出现了1700 bp和2500 bp左右两个DNA片段，表明目的DNA片段已与质粒连接。4 讨论通过实验验证分析，可以看出，葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆已经完成，且转染顺利，下一步的目标是将其进行转接至质粒中，进行染色观察其是否表达，并进行组织表达分析，以确定其在生长发育过程中对

18、逆境起到的具体作用。以研究葡萄逆境胁迫诱导型启动子对植株生长发育的调控及在育种中的应用。但是最后的正反序鉴定结果中并没有检测出正反载体的结果，可能原因是： 提取的质粒不纯有杂质，进行正反鉴定切不出结果。所用的Stu 酶失活没有将目的基因切开。目的基因没有完全连接到载体上，没有出现Stu 酶的酶切位点。应该用其他酶进行酶切比较试验。5 前景与展望植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究经过多年的努力，方法和技术体系已日益成熟，并取得了很大的进展，已获得了很多与植物胁迫抗性相关的基因位点和胁迫相关基因，调控元件和转录因子，随着植物逆境胁迫抗性的功能基因组研究的深入，人们将会对植物逆境胁迫抗性的生理生化的分

19、子机理有一个全面的认识，进而把握与其相关的基因数目及其在代谢和调控中的作用，合理地选择和优化植物逆境胁迫抗性中的关键代谢和调控过程的基因，用于植物逆境胁迫抗性的标记辅助选育和基因工程改良，促进逆境胁迫抗性的作物材料和品种的育成和生产应用。致谢感谢青岛农业大学生命科学学院四年来的培养，在此，我真诚地向我尊敬的老师们和母校表达我深深的谢意！这篇论文是在我的导师薛仁镐老师的多次指导下完成的。从论文的选题到结构安排，从内容到文字润饰，都凝聚了他大量的心血。在这篇论文的写作过程中，薛仁镐老师不辞辛劳，多次与我就论文中许多核心问题作深入细致地探讨，给我提出切实可行的指导性建议，并细心全面地修改了我的论文。

20、薛仁镐老师对本论文从选题、构思、资料收集到最后定稿的各个环节给予细心的指引和教导 ，并最终得以完成毕业论文，对此，我打心眼里表示我最衷心的感谢.薛老师严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度、积极进取的科研精神以及诲人不倦的师者风范是我毕生的学习楷模。薛老师的高深精湛的造诣与严谨求实的治学精神将永远激励着我。薛老师这种一丝不苟的负责精神，使我深受感动。在此，请允许我向尊敬的薛仁镐老师表示真挚的谢意！其次，我要感谢魏璇师姐。在百忙之中抽出时间指导我做实验，帮助我搜集文献资料，帮助我理清论文写作思路，对我的论文提出了诸多宝贵的意见和建议。对师姐的帮助表示真挚的感谢。 在论

21、文的写作过程中，也得到了许多同学的宝贵建议，同时还得到实验室其他师姐的支持和帮助，在此一并致以诚挚的谢意。 最后，衷心感谢所有老师对我的栽培、支持和鼓励，感谢所有朋友的关心和帮助。向在百忙中抽出时间对此论文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢！参考文献：1 孔庆山主编.中国葡萄志.中国农业科学技术出版社.2004. 2 李杨汉主编.植物学Z .上海科学技术出版社出版.1984.3 贺普超主编.葡萄学Z.中国农业出版社出版.1999.4 Backhaus R ARubber formation in plants1 mini-reviewIsrael J Bor,198534：283-

22、2935 Joshi C PAn inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genesJNucleic Acids Res,1987，15：6643.6 Uno Y，Furihata T,Yoshida H A R，et a1Arabidopsis basic leucine zipper transcription factors involved in an abscisic acid-dependent signal transduction pathway under drought and high-salinity conditionsJPNAS，2000, 97：11632-11637.7 Liu S，Kriz A，Duncan D，et a1Abscisic acid-regulated Glbl transient expression in cultured maize P3377 cellsJPlant Cell Rep, 1998，17：650-655.8 Chung H J，Fu H Y，Thomas T LAbscisic acid-induciblenuclear