补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因

1、补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷含药血浆抗血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞增殖的作用         11-01-25 10:25:00     作者：李花, 陈刚, 邓常    编辑：studa20【摘要】  目的：研究补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN)含药血浆对血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor

2、，PDGF）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的影响。方法：采用血浆药理学方法及PDGFBB诱导VSMC增殖模型。以甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测空白血浆对VSMC生长的影响和含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度，确定补阳还五汤及其有效组分和三七总皂苷用药浓度。MTT法和流式细胞术检测补阳还五汤及有效组分和TSPN、阿托伐他汀对VSMC增殖活性及细胞周期的影响。结果：PDGFBB剌激后，VSMC增殖活性显著增强，G0/G1期细胞数减少，G2/M期和S期细胞数增多

3、。与PDGFBB剌激组比较，补阳还五汤、有效组分生物碱和苷、TSPN、阿托伐他汀等含药血浆均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖，增加G0/G1期细胞数，减少G2/M期和S期细胞数。结论：补阳还五汤及其有效组分和TSPN均可抑制PDGFBB诱导的VSMC增殖。生物碱和苷可能为补阳还五汤中抗VSMC增殖的主要药效物质，补阳还五汤及其有效组分生物碱和苷具有与阿托伐他汀、TSPN相似的抗VSMC增殖的作用。 【关键词】  补阳还五汤; 生物碱; 苷; 三七总皂苷; 血浆药理学; 血管平滑肌细胞; 细胞增殖Objective: To explore the effects of plasma

4、 containing Buyang Huanwu Decoction (BYHWD), a compound of traditional Chinese medicine, and its effective components (alkaloids and glycosides) and total Panax notoginseng saponins (TSPN) on vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation induced by plateletderived growth factor (PDGF) in vitro.Me

5、thods: VSMC proliferation was induced by incubating VSMCs with PDGFBB. Effects of different concentrations of blank plasma on the VSMC proliferation and 50% inhibitory concentrations of plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin were detected by using methyl thiazol

6、yl tetrazolium (MTT) method to determine the concentrations of plasma containing drugs for the following experiments. Then, MTT and flow cytometry methods were used to detect the effects of plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin on VSMC proliferative activity an

7、d cell cycles.Results: VSMC proliferative activity was enhanced obviously after PDGFBB stimulation. The cell number in G0/G1 phase was decreased and the cell quantity in G2/M and S phases was increased following PDGFBB stimulation. Compared with PDGFBB stimulation group, VSMC proliferation induced b

8、y PDGFBB in plasma containing BYHWD, its alkaloids and glycosides, TSPN and atorvastatin groups was inhibited. In all plasma containing drug components groups, the cell number of G0/G1 phase was higher and the cell quantity of G2/M and S phases was lower than those in the PDGFBB stimulation group.Co

9、nclusion: BYHWD and its alkaloids and glycosides have similar roles of resisting VSMC proliferation to TSPN and atorvastatin. Alkaloids and glycosides may be the major effective substances of antiVSMC proliferation in BYHWD.Keywords: Buyang Huanwu Decoction; alkaloids; glycoside; total Panax notogin

10、seng saponins; plasma pharmacology; vascular smooth muscle cell; cell proliferation血清药理学方法是给动物灌服中药或复方一定时间后，取其血清进行体外实验的一种方法1。尽管血清药理学方法在中药和复方药理研究中有重要的作用，但其局限性也日益受到关注。在制备血清时由于血液凝固等的影响，血清药理学方法并不符合中药在体内的真实过程，含药血清中的“药效物质”可能并不能正确反映中药的有效成分。因而有人提出了用含药血浆进行中药或复方体外实验的“血浆药理学（plasma pharmacology）”方法2，这种方法有可能成为中药药

11、理研究的重要方法之一。    补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BYHWD）为中医药治疗脑缺血、缺血性心脏病的有效方剂。我们的研究表明，该方中的生物碱、苷类组分为其主要的有效组分。该方及其有效组分生物碱和苷可抑制大鼠主动脉球囊导管损伤后血管内膜的增生，降低增生内膜中增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、cyclin D1、cyclin E和细胞外基质成分型胶原（collagen ，Col)、纤联蛋白（fibronectin, FN）的表达，能抑制血管内膜损伤后血管平滑肌细胞（va

12、scular smooth muscle cell，VSMC）细胞周期的激活，阻抑细胞增殖，抑制细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的合成和促进其降解3,4。三七总皂苷（total Panax notoginseng saponins，TSPN）是从中药五加科植物Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen干燥根中提取的皂苷类有效组分，是三七的主要药理活性成分，在三七中含量高达8%12%，其主要有效成分是人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）和三七皂苷R1（notoginsenos

13、ide R1）等。研究表明，TSPN可显著抑制高脂血清对VSMC的促增殖作用5，抑制主动脉球囊损伤血管内膜增生模型大鼠血管内膜增生，降低增生内膜中cyclin D1、cyclin E和FN的表达，增强基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9，MMP9)的表达，提示TSPN可抑制血管内膜损伤后VSMC的过度增殖，减少ECM的沉积6。由于VSMC在血管增殖性病变中具有重要的地位，为了进一步阐明补阳还五汤、补阳还五汤有效组分及TSPN的作用环节，本研究采用血浆药理学方法和血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF）诱导的VSM

14、C增殖模型，研究补阳还五汤、 补阳还五汤有效组分和TSPN对VSMC增殖的影响。1  材料与方法1.1  实验材料1.1.1  实验动物  SpragueDawley大鼠，由湖南省卫生防疫站实验动物中心提供，体质量120150 g，雌雄各半，合格证号为医动字第20010号。饲养在室温1820 ，湿度65%70%的环境中，自由饮水进食。1.1.2  实验试剂  达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）和胰蛋白酶（1250）购自美国Gibico公司。DMEM培养基以超纯水配制

15、，过滤除菌，20 保存。胰蛋白酶以超纯水配成0.25%溶液，过滤除菌后分装，20 保存。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），购自杭州四季青试剂公司，56 灭活补体30 min，过滤除菌后分装，20 保存。甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、PDGFBB和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），均购自Sigma公司。碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNA酶抑制剂（RNase inhibitor），均购自北京鼎国生物科技有限公司。其余试剂均为分析纯。1.1.3  实验药物

16、60; 补阳还五汤由黄芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、当归9 g、地龙9 g、红花9 g、桃仁9 g组成。按我们以往的方法4提取原方水提取物和其有效组分生物碱、苷。补阳还五汤生药浓度为1 g/mL。以高效液相色谱法测定各提取物中有效物质的含量。苷类组分中黄芪甲苷含量为1.40 mg/g，芍药苷为19.11 mg/g，苦杏仁苷为17.92 mg/g；补阳还五汤中含黄芪甲苷0.38 mg/g，芍药苷1.16 mg/g，苦杏仁苷0.90 mg/g；生物碱类组分中川芎嗪含量为6.00 mg/g；补阳还五汤中川芎嗪含量为0.01 mg/g。以去离子蒸馏水将苷类有效组分配成苷含量为0.71 g/mL的

17、溶液，将生物碱类有效组分配成生物碱含量为0.08 g/mL的溶液待用。    TSPN，购自广西梧州制药（集团）股份有限公司，批号为071119。经检验，TSPN为淡黄色无定形粉末，味苦微甜，易溶于水。用薄层色谱鉴别，具有人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的特征性斑点，水溶液pH 6.1。以高效液相色谱法测定其主要有效成分6，可见到人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的特征性色谱峰，含人参皂苷Rg1 50.4%，人参皂苷Rb1 30.9%，三七皂苷R1 12.5%。    阿托伐他汀（atorvastatin)，10

18、 mg/片，Godecke GmbH生产，辉瑞制药有限公司分装，批号为080117。临用时以去离子蒸馏水配成2 mg/mL混悬液。1.2  实验方法1.2.1  大鼠主动脉VSMC的培养和鉴定1.2.1.1  原代细胞培养  采用组织贴块法培养原代细胞。每次取大鼠23只，处死，75%酒精消毒，切开胸腹部，无菌条件下分离胸腹主动脉，以Hanks液洗净，剪去血管外小分支。移入含20% FBS的DMEM中，剪开血管腔，以镊子轻轻擦拭内膜层35次去除内皮细胞。然后将血管放入DMEM中（含20% FBS），剪碎血管至1 mm2左右大小。将组织块转入培养瓶中，均匀贴

19、壁，组织块间距为0.5 cm。盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，并向瓶内注入适量含20% FBS的DMEM液，于37 、5% CO2培养箱内放置45 h，使组织块干涸，并与瓶底贴附。然后将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置35 d。待有细胞从组织块周围游离出后，采用半量换液方式换液，23 d换液1次，待原代培养23周至细胞长成致密单层即可传代。1.2.1.2  细胞传代及培养  取原代生长的VSMC，以Hanks液洗涤后，加入0.25%胰蛋白酶消化，以FBS终止反应，DMEM洗涤后，以含20% FBS的DMEM制成106/mL细胞悬液进行传代培养，以1

20、2的比例传代。1.2.1.3  细胞鉴定  实验用46代VSMC。用免疫细胞化学法测定VSMC 平滑肌肌动蛋白的表达，进行细胞鉴定。1.2.2  含药血浆的制备  按文献方法7将大鼠随机分为空白组、阿托伐他汀组、补阳还五汤组、生物碱组、苷组和TSPN组，每组1012只。空白组灌胃等量蒸馏水（给药体积为10 mL/kg），补阳还五汤组灌胃补阳还五汤（生药量22.2 g/kg），生物碱组灌胃生物碱类有效组分（1.66 g/kg），苷组灌胃苷类有效组分（14.2 g/kg），TSPN组灌胃TSPN（200 mg/kg），阿托伐他汀组灌胃阿托伐他汀（20 mg/

21、kg）。每天给药两次，分别在上午9时和下午4时。连续灌胃7次后，于末次给药后2 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，以1.5% EDTANa2抗凝（血液抗凝剂=91），4 、3 000 r/min离心15 min取血浆。将各给药组各鼠血浆等量混合即为含药血浆，空白组各鼠血浆等量混合即为空白血浆。过滤除菌后分装，70 保存。1.2.3  空白血浆对VSMC生长的影响  采用MTT法测定。VSMC培养于96孔培养板，然后以无血清DMEM培养24 h使细胞生长同步化于G0期，分别加入不同浓度空白血浆（终浓度为0%、1%、5%、10%、15%、20%、25%），每孔总体积

22、200 L。培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 L，4 h后倾去培养液加入DMSO 200 L，振荡10 min后酶标仪上检测490 nm处光密度值（optical density，OD），计算空白血浆对VSMC生长的抑制率（inhibitory rate，IR）：IR=1(实验组OD值/空白组OD值)×100%。空白血浆的每个浓度在同一培养板上重复5次。取IR20%的血浆浓度作为对细胞正常生长无影响的浓度。1.2.4  含药血浆对PDGFBB诱导的VSMC增殖的半数抑制浓度测定  采用MTT法测定各含药血浆对VSMC增殖抑制的半数抑制浓度（50%

23、inhibitory concentration，IC50）。各含药血浆分为无血浆空白对照组，PDGFBB刺激组，终浓度分别为1%、5%、10%和15%的血浆组。VSMC培养于96孔培养板，然后用无血清培养基培养24 h使细胞生长同步化于G0期，再分别加入不同终浓度的各含药血浆。3 h后加入PDGFBB（终浓度10 ng/mL），总体积为200 L。培养24 h后，加入MTT（5 mg/mL）20 L，4 h后倾去培养液加入DMSO 200 L，振荡10 min后检测490 nm处OD值。各含药血浆的每个浓度重复5次，IR（PDGFBB刺激组OD值含药血浆组OD值）/（PDGFBB刺激组OD值

24、无血浆空白对照组OD值）×100%。以含药血浆浓度为自变量，IR为因变量进行logistic回归分析，求出各含药血浆抑制50% VSMC增殖的浓度（IC50）。1.2.5  PDGFBB诱导的VSMC生长曲线的测定  采用MTT法。VSMC培养于96孔培养板，然后用无血清培养基培养24 h使细胞生长同步化于G0期。实验设为无血浆空白对照组、PDGFBB刺激组、空白血浆组、阿托伐他汀含药血浆组、补阳还五汤含药血浆组、生物碱含药血浆组、苷含药血浆组和TSPN含药血浆组。无血浆空白对照组每孔加入200 L培养液。PDGFBB剌激组加入180 L培养液，3 h后加入PDG

25、FBB（终浓度10 ng/mL）20 L。空白血浆组和各含药血浆组分别加入160 L培养液、20 L空白血浆或含药血浆（终浓度为10%，各含药血浆终浓度约为各含药血浆的IC50），3 h后加入PDGFBB 20 L。37 、5% CO2继续培养。分别于0、12、24、48 h后取出培养板，每孔加入20 L MTT（5 mg/mL），继续37 、5% CO2孵育4 h。吸除培养板各孔液体，每孔加入200 L DMSO并震荡10 min，测定各孔490 nm OD值，以OD值反映VSMC的增殖活性。1.2.6  VSMC细胞周期的测定  将培养细胞分为无血浆空白对照组、PDGF

26、BB刺激组、10%空白血浆组、10%阿托伐他汀含药血浆组、10%补阳还五汤含药血浆组、10%生物碱含药血浆组、10%苷含药血浆组和10% TSPN含药血浆组。用无血清培养基培养24 h使细胞同步化于G0期，然后分别加入各含药血浆，3 h后除无血浆空白对照组外各组均加入PDGFBB（终浓度10 ng/mL），培养24 h后用流式细胞分选术测定VSMC细胞周期。取约1×106个细胞/mL，用75%酒精固定后用PBS洗一遍，室温、避光下PI染色(含PI 50 g/mL，RNase inhibitor 100 g/mL，0.1% Triton X100)，至少30 min后上机测定，流式细胞

27、仪（型号FACSCalibur，美国BD公司生产）上检测各细胞周期的百分率，CellQuest软件分析结果。1.3  统计学方法  应用SPSS 16.0统计学软件进行分析。实验结果数据采用x±s表示。多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者用LSD法检验，方差不齐者用Dunnets T3法检验。检验水准=0.05。2  结果2.1  VSMC鉴定  倒置显微镜下，培养的VSMC贴壁生长，细胞呈长梭形，放射性生长，细胞胞质透明，相互融合在一起。成束的细胞平行排列，呈铺路石样“峰谷”状生长。可见到VSMC胞浆中平滑肌肌动蛋白呈阳性表达，纯度达90%以上。表明培养的细胞为VSMC。2