广东地区丙型肝炎患者的HCV基因分型研究

1、广东地区丙型肝炎患者的HCV基因分型研究    摘要nbsp;目的：了解广东地区慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型情况，为丙型肝炎病毒的诊断和预防提供有力依据。方法:nbsp;根据丙型肝炎病毒RNA全序列,在5-NCR区设计引物，通过套式PCR扩增     胡斌1 张孝文2 程钢1 何蕴韶1 劳绍贤3 （ 1 中山大学达安基因诊断中心,广州，510089 2.中山大学附属第三医院，广州，510630 3.广州中医药大学第一附属医院,广州，510405) 作者简介：胡斌，男，1970年10月出生，硕士，讲师，从事专业为

2、分子生物学与基因诊断。 摘要 目的：了解广东地区慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型情况，为丙型肝炎病毒的诊断和预防提供有力依据。方法: 根据丙型肝炎病毒RNA全序列,在5-NCR区设计引物，通过套式PCR扩增，特异性产物测序分析并分型。结果：检测HCV感染样本58例，扩增出阳性样本47例，共检出3种基因型，分别为1b,2a和4型，其中1b占85.1，2a占12.8，4型占2.1，4型为中国人群中极少报道被检出的罕见型。结论：广东地区HCV基因型主要为1b型，其次为2a型，与中国其它地区HCV基因型分布比较一致。 关键词：丙型肝炎病毒，套式RT-PCR，测序，基因分型 The study of t

3、he genotyping of Hepatitis C Virus in Guangdong Hu Bin1 Zhang Xiaowen2 Cheng Gang1 He Yunshao1 Lao Shaoxian3 1 DA AN Gene Diagnostic Center OF Sun Yat-sen University,Guangzhou 2 The third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 3 First Affiliated Hospital of Guangzhou University of T

4、raditional Chinese Medicine Abstract Object To investigate the prevalent condition of Hepatitis C Virus(HCV) in Guangdong for giving the powerful proof in the diagnosis and precaution of HCV. Method The primer in the domain of 5-NCR was designed and the nested PCR product was detected through revers

5、e transcription polymerase chain reaction . The genetype of HCV was determined by the results of the saquences.Result 58 samples were detected and three kinds of genotype' including 1b(85.1%),2a(12.8%) and 4 (2.1%)were found in 47 positive samples. Conclusion The main genotype of HCV in Guangdon

6、g is HCV1b followed by HCV 2a.The prevalent strains of HCV in Guangdong compared with other districts in China is approximately identical. Key words Hepatitis C;PCR;Genetype; 丙型肝炎病毒（HCV）感染和输血后肝炎密切相关，大部分HCV患者会逐步演变为慢性感染，并根据病程轻重发展为肝硬化或肝癌。HCV病毒基因有较强的变异性，变异位点可发生在基因组的各个区域，根据变异位点的不同将HCV分为不同型别。由于HCV的感染严重程度和

7、预后均与其分型关系密切，本研究拟通过分析部分广东地区的慢性丙肝患者体内HCV病毒分型情况，为热带地区丙型肝炎病毒的临床诊断和疾病预防提供一定的实验依据。 1 材料与方法 1.1 标 本 HCV RNA 阳性病人血清收集于中山大学附属第三医院，共50例病人。取2ml EDTA抗凝全血后分离血清，70冻存备用。 1.2 仪 器 ABI 3900台式高通量DNA合成仪为美国应用生物系统公司（ABI）产品。 WATERS 600 高压液相色谱仪为美国WATERS公司产品。 PE 9600型全自动PCR仪为美国应用生物系统公司（ABI）产品。 1.3 试 剂 套式PCR引物由中山大学达安基因诊断中心合成

8、并纯化，逆转录试剂购自德国QIAGEN公司，PCR检测试剂是中山大学达安基因诊断中心产品。 1.4 方 法 1.4.1 提取核酸 采用异硫氰酸胍（TRIZOL）一步法抽提血清中游离病毒RNA, 75%乙醇洗涤RNA沉淀，DEPC处理水溶解RNA，-80保存备用。 1.4.2 套式RT-PCR扩增 1.4.2.1引物设计合成：引物根据HCV病毒RNA的全长序列设计，设计区域选择HCV RNA 5-NCR区，计算机辅助设计软件为PrimerExpress 2.0，引物由中山大学达安基因诊断中心的ABI 3900台式高通量DNA合成仪合成并经过高压液相色谱仪纯化，序列如下: 外扩增上游引物F1: 5

9、-ACTCCACCATAGATCACTCC-3 外扩增下游引物R1: 5-GAACTTAACGTCCTGTGGGC-3 内扩增上游引物F2: 5-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3 内扩增下游引物R2: 5- ACCCTATCAGGCAGTACCAC -3 1.4.2.2 cDNA合成：取模板RNA 5ul，5×缓冲液5ul，dNTPs lmM,引物R1 20pmol，逆转录酶M-MLV200u，RNasin 20u(Promega)，加DEPC水补足至25ul，混匀，37孵育1小时，955min后，-70保存。 1.4.2.3 套式PCR外扩增：取上述cDNA 5ul进行

10、PCR扩增，5×缓冲液10ul，引物F1及R1各25pmol,dNTPs200 umol,MgCl2 1.5mM,Taq酶2.5u,加ddH2O补充至50 ul，用灭菌石腊油覆盖液面，置PE 9600 型全自动PCR仪94预变性7分钟后，再依次25个循环，每次循环条件为93 1分钟，54 50秒，72 1分钟，最后72延伸10分钟，得到外扩增PCR产物。 1.4.2.4 套式PCR内扩增：取上述外扩增PCR产物5ul为模板，5×缓冲液10 ul，引物F2及R2 各25pmol,dNTPs 200umol, MgCl2 1.5mM,Taq酶2.5u,加ddH2O至50ul，用

11、灭菌石腊油覆盖液面，置PE 9600 型全自动PCR仪94预变性7分钟后，再依次循环35次，每次循环条件为93 1分钟，55 1分钟，72 1分钟，最后72延伸10分钟，得到内扩增PCR产物，整个实验过程均设置阴性及阳性对照。 1.4.3 HCV基因测序分型 内扩增PCR产物全长245bp,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，PCR产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。根据每个样本的测序结果进行HCV基因分型。 2 结 果 实验共58份血清标本，PCR产物测序共得到阳性结果47例，其中1b型40例(85.1%)，测序图略；2a型6例(12.8%)，测序图略；4型1例(2.1%)，其部分测序图谱

12、见图2，箭头标注处表示此位点碱基由其它型别的C变异为T。 3 讨 论 丙型肝炎病毒(HCV)基因组为一条线性正链单股RNA，长约9.5Kb，主要由5及3端非编码区（NCR）和一个大的单一开放读码框架（ORF）组成1。HCV基因容易发生变异，变异可产生于全基因序列的各个区域2。由于HCV基因的变异性较大，客观上存在很多的型别，给临床的诊断带来一定的难度。根据其基因序列进行分型，可从分子生物学的角度对HCV的高变异性增加更多的认识，对进一步研究HCV病毒的流行病学规律，为丙型肝炎的临床诊断和治疗方法的改进提供更多的依据。NCR区为基因的保守序列，Simmonds 根据HCV的5-NCR区序列的差异

13、，建立了HCV基因组序列分型法，将HCV分为6种基因型和31多种亚型3。在此分型方法的基础上，目前已报道的基因型有11个，基因亚型超过70种4。 HCV病毒主要通过输血和血液制品传播，与慢性肝炎和肝癌的发生有密切关系5。HCV病毒分型具有一定的地域性，1a多见于欧美地区，1b和2a型在亚洲地区分布广泛，4型多分布于印度、北非及中东地区3，6，我国多见1b、2a型7，8。本研究收集了广东地区慢性丙型肝炎患者58例，用高灵敏度的套式RT-PCR方法扩增病毒RNA并通过测序鉴定，检测了患者血清中HCV的分型情况，共扩增出阳性样本47例，结果表明所检测患者共有3种HCV基因型的分布，分别为1b,2a和

14、4型，其中1b占85.1，2a占12.8，4型占2.1，1b为主要的流行型别，与中国其它地区HCV的研究报道结果比较一致7，8。从目前国内的研究结果来看，基本没有HCV4型的报道，4型主要在中东及周边地区流行。广东地区作为对外开放的前沿阵地，随着国际交流的增多，大量外籍人士定居此地，是HCV 4型在本地出现的重要外在因素。这种病毒流行趋势的改变是一个长期的渐进的过程，应该引起本地疾病控制和流行病监测部门的高度重视，当然也不排除病毒株自身基因突变的可能。 作为HCV分型最准确可靠的方法，本研究采用套式RT-PCR方法扩增特异性HCV基因片段，进行核苷酸序列测定分析确定基因型别，研究了部分广东地区

15、HCV病人的病毒基因分型情况，从分子生物学的角度初步反映了该地区HCV病毒的型别分布。由于本研究收集样本的数量有限，进一步的结果尚有待与相关流行病调查机构和医院展开科研合作，为HCV所致肝炎的疾病控制和诊断治疗提供更多的实验依据。 参考文献 1 路福兴，藏隽编译。丙型肝炎流行病学。国外医学（病毒学分册），1998，5（4）：109111 2 张永祥。丙型肝炎病毒基因分型及其临床意义的研究进展。国外医学（流行病学传染病学分册），1998，25（2）：53 3 P.Simmonds,F.McOmish,P.L.Yap,S.-W.Chan,et al.Sequence variability in

16、the 5-non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity.Journal of General Virology,1993,74:661-668 4 Liew M,Erali M,Page S,et al.Hepatitis C genotyping by denaturing high-performance liquid chromatography.Clin Microbiol,2004,42(1):158 5 Saito I, Miyamura T, Ohbayashi A, Harada H, Katyama T, et al. Hepatitis C virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA