利用Cas9-gRNA-体外细胞水平敲除基因

1、利用Cas9/gRNA体外细胞水平敲除基因的protocolCas9靶位点的选择1 .基因靶位点的选择遵循GGN(17-18)NGG(N为任意碱基)的序列要求， 其中GGN(17-18)是与靶基因结合的位点，NGG是Cas9蛋白切割所必须的PAM(protospacer-adjacentmotif)区。因为我们实验室所用的pU6-gRNA体外转录载体是U6启动子， 所以要求第一位碱基为G,第二位碱基可任意修改。 止匕外，可在正义链或反义链上选择靶位点。图1.Cas9的作用原理(引自Malietal.,2013)2 .对于codinggene,靶位点尽量选择在基因CDS的前2/3区域并且在ATG

2、之后，但是不要在最后一个exon上； 最好能破坏重要的domain和/或所有的isoform/variant。同时还要考虑避免在第一个起始密码子的下游还存在额外的具有相同阅读框(in-frame)的起始密码子。靶点也可选择在intron和exon交界处，以破坏基因的剪接。原则上不要选择5-UTR和3-UTR可参考如下的Cas9靶位点预测网站：/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx二、Cas9靶位点的确认-NNNNNNNNw%UiAGCCACGGUGAWIAAGUUC乩一二二二JUJUQn00aRrXJQn00aRrXJu uLu

3、Luu uA A1,确认靶点在基因组中的唯一性： 靶位点序列在Ensembl/NCBI网站进行blast,确认是基因组中的单一位点。2 .PCR扩增靶点序列：从准备用于打靶的样品中PCRT增靶点及附近的序列。在靶位点周围设计引物，使其距离靶位点两侧都大于100bp,并且PCRT增产物最好不要超过500bp,且为单一条带。3.检测酶切效率：如果计划采用酶切法检测靶点的突变情况，则需要对上述PCR产物进行酶切验证。要求尽量酶切完全，并且电泳后能明显与原条带区分开。4 .测序确认靶点序列：将PCRT物直接送去测序（不需要TA克隆）。如果实测序列跟靶点的预测序列有出入，原则上应根据实测结果设计gRNA

4、序列；但是，如果实测序列不再符合靶点选择的原则（例如，PAM区不是NGG,或5端不是GG）,则应重新选择靶点。三、构建gRNA-target载体1,靶位点退火成含黏性末端的小片段选择了合适的靶位点之后，根据靶位点合成两条oligo（均为24nt,s序列与靶序列同向，As反向），如下：s引物序列为：CACC|GN（19）As引物序列为：AAAC|GN（19）的反向互补的序列按照下列条件在1.5mlEP管中配置反应液后，2.空载体(pU6-gRNA)的线性化pU6-gRNA(U6-gRNA_cloningvector(BbslX图谱，3927bp)质粒含有两个Bbs组分体积s 引物(10uM)10

5、MLAs 引物(】0RMA10ULBuffer3(NHB)5uLddH2025uLTotal50uL用一个烧杯装满水，在微波炉里加热至沸腾后，把配置好的反应液置入大烧杯中，继续中火加热10min后，取出大烧杯自然冷却至室温后取出1.5mlEP管瞬时离心备用。I酶切位点，其部分序列如下图:TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTAC|GTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGA

6、TATTA|CAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACAqGGTCTTCGAGAAGACC6TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTAL-gRNA与退火靶位点的连接用TAKA

7、RA公司提供的solutionI,在PCR管中配置反应液混匀后，组分体积16C,30min(时间/、宜过长,因L-gRNA0.5HL为连接片段只有20bp)o然后转退火的靶位点4.5uL化，涂卡那(kanamycin)抗性的Solution15uL平板，第二天后挑取2-4个菌落TotallfJnL扩大培养提取质粒送测序，测序物用通用引物SP6正向测序。测序正确的gRNA质粒备用。具体步骤如下：10仙L连接产物+50LLTop10感受态细胞一混匀后，冰上放置30min-42C,90s一冰上冷却约3min一加入500pL无抗性LB培养基，37c摇床中摇晃30min一取250L涂卡那平板，过夜培养一

8、挑取单个菌落。pU6-gRNAplasmid（300ng仙）30ul（弋10ug）37C,4h;10*Buffer5ul切胶回收，BbsI（FD）5ul30ulddH2O溶解。ddH2OTo50ul-20C保存，以后可用。方框将U6启动子；GTCTTC和GAAGAC为两个BbsI酶切位点，切后产生绿色标记的粘末端;粘末端之中；酶切体系:3.L-gRNA与退火靶位点的连接CAAGATACGTATTATG20bp靶点插入制作好的gRNA测序回来后比对：要完全匹配(把靶位点置换GN19)U6promoter+targetRNA+guideRNAscaffoldTGTACAAAAAAGCAGGCTTT

9、AAAGGAACCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGN

10、NNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA四、准备转染细胞所需的CMV-hCas姒核:pcDNA3.3-hCas9(addgene41815)该质粒有图谱，9553bp。五、转染细胞1.细胞系的选择：根据打靶基因及打靶样品，确定所需要的细胞系。例如，如在小鼠中打靶某个基因，则可以选择3T3细胞系，最好是选择该品系小鼠的ES细胞或是该小鼠品系所建成的细胞系。2 .转染方法：参见Lipofectamine?2000DNATransfectionReagentProtocolCMV-hCas9直接使用（氨节抗性）：U6-gRNA-BbsI（卡那抗性）=3:1转染即可六、筛选携带靶位点突变的单个克隆细胞1 .抗性筛选：转染细胞24h后，换成新鲜培养基，加G418（白色粉末，融点138144C,溶于水、甲醇。1g包装的G418瓶子中，加入10ml/（2ml）HEPES容液，浓度为100/（500）mg/ml完全溶解后，0.22um过滤，20度保存。）筛选。浓度：500-800ug/ml,G418保存浓度为500ug/ul.筛选时间约10-14大。2 .单个克隆