本科生六个基本生物学实验

1、实验一：感受态细胞的制备1. 原理 ： 当实验室获得了一个新的质粒时，而这个质粒并未转化到宿主菌体内，则需 要该技术进行细菌的转化， 以大量获得这一质粒。 转化细菌的方式有很多种， 如 电转化法、脂质体转染法、显微注射法、 CaCl2 处理法制备感受态细胞等。一般 的实验室都应用 CaCl2 处理细菌，改变细胞膜的结构，使质粒 DNA 能穿过细菌 细胞膜进入细胞。 然后在选择培养基中培养转化处理过的细菌， 转化成功的细菌 可在抗菌素培养基上生长形成菌落。这一方法是分子生物学常用实验方法。2. 实验材料2.1 LB 液体培养基2.2 O.1mol/L CaCl2溶液：称取1.1g无水CaCb,溶

2、于90ml双蒸去离子水中， 定容至100ml，用0.22卩山滤器过滤并装入灭菌试剂瓶中，4C保存。2.3 DH5a菌株，冰，牙签，无菌滤纸，50ml离心管，枪头（以上需灭菌）； 移液器，摇床，冷冻离心机，涡旋震荡器，恒温摇床，恒温培养箱，超净工 作台，普通冰箱，-70 C冰箱3. 操作方法3.1从37C培养1216h的平板上，用无菌牙签挑取一个单菌落，转移到 含有3ml LB培养基的试管内，37T振摇过夜。次日取菌液1ml，接种到含有100ml LB培养基的 500 ml烧瓶中，37E剧烈振摇培养约2 3h （振摇速度为200300r/min）， 待 OD600 值达到 0.30.4 时， 将

3、烧 瓶取 出立即置 冰浴 1015min。3.2 自该步骤起皆需无菌操作。在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理 过的、冰预冷的50 ml离心管中。3.3 4C离心，4000g>5min回收细胞。3.4弃去培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。3.5 加入冰预冷的O.1mol/L CaCl2溶液10ml重悬菌体，置冰浴30min。3.6 4C离心，4000g>5min,弃去上清液，倒置于滤纸 1min。3.7再加4ml用冰预冷的0.1mol CaCl2重悬菌体（重悬时操作要轻）。3.8置4°C冰箱置12 24h，即可应用于转化。思考题：制备感受态细

4、胞时加入CaCb的作用是什么？钙离子结合于细胞膜上，使细胞膜呈现一种液晶态。在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙，细胞膜的通透性发生变化，使外源 DNA 进入实验二质粒转化1. 原理 当宿主菌接受 CaCl2 处理后，细胞膜通透性改变，感染细菌 的质粒很容易地透过细胞膜，在宿主菌酶系统的作用下，质粒大 量繁殖。通过进一步实验，可获得大量的质粒 DNA ，以供分子 生物学实验所用。一般的实验室都应用 CaCb处理细菌。2. 实验材料2.1，质粒 GFP-SNAT2-pBK-CMV （kan 抗性）2.2, LB固体培养基平板（kan抗性），LB液体培养基2.3，感受态细胞2.4， 1.5

5、ml离心管，枪头，三角耙（以上物品需灭菌处理）；移液器， 冰，恒温水浴锅，恒温摇床，恒温培养箱，超净工作台，-70 C冰箱3. 操作方法3.1无菌状态下取新鲜感受态 50卩置于无菌的1.5ml离心管。3.2 每管加质粒 50100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置 30min。3.3 42E热休克90s，不要摇动离心管。3.4 每管加无抗生素的普通LB培养基950Z37C （150 180r/min）摇床, 温和摇振 45min。3.5用无菌弯头玻璃铺菌器（三角耙），将10卩1菌液铺于含卡那青霉素 （Kan）的琼脂平板表面，37C平放20min，然后倒置培养10 14h。4. 结果观察计数

6、全皿菌落数5. 写实验报告（详细描述转化菌落的生长情况）6.思考题请说明每一步骤的原理：冰上 30分钟、 42度热休克 90秒、37 度温和震荡 45 分钟等。冰上 30分钟：转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 -钙磷酸复合物 粘附于细胞表面。42度热休克 90秒： 42 度短暂的热刺激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰 动，并随即出现许多间隙，促进细胞吸收 DNA 复合物。37度温和震荡 45 分钟：促使在转化过程中获得新的表型得到表达实验三 质粒 DNA 的抽提和纯化1.原理：质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。 一般情况下， 质粒 并不是它的宿主细胞所必需的， 如

7、细胞分裂时， 分裂的子细胞中不含质粒， 但子 细胞仍能生长分裂。 然而，许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。 尽 管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行，但质粒 DNA 是独立于宿主基因组 以外的环状分子， 对于碱的裂解具有较强的耐受性， 因此， 用碱裂解法可将质粒 DNA 与宿主的线性 DNA 分开。2 材料2.1质粒DNA小抽试剂盒，乙醇2.2 含质粒的菌液(GFP-SNAT2-pBK-CMV /)2.3 离心管，枪头(以上物品需灭菌) ；移液器，离心机3步骤见试剂盒说明书实验四 琼脂糖凝胶电泳1. 原理：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis

8、。各种生物大分子在一定的 pH 值条件下，可解离成带电荷的离子，在电场中向相反的电 极移动。分子生物学领域中， 琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用 最多，它们是分离、鉴定和纯化 DNA 及 RNA 片段的主要方法。该方法操作简 便、快速，可以分辨其它方法 (如梯密度离心法 )所无法分离的片段。直接嵌入荧 光染料后，在紫外灯下可直接检出 DNA 片段所在的位置，如有必要，从凝胶中 回收 DNA 片段，用于各种克隆操作。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块， 在不同的装置上进行电泳。 琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低， 但其分离范围 广，约200bp50kb的D

9、NA。琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。聚丙烯酰 胺分离小片段(5500bp)的效果较好，甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。长度 大于10 000kb的DNA片段，可以通过电场方向呈周期性变化， 在脉冲电场胶中 进行电泳。2. 琼脂糖凝胶的性质：琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物，琼脂糖凝胶点为4045C。当加热至90C左右时，即可成清亮、透明的液体，浇在模具上冷却后固化形成凝胶，琼 脂糖凝胶可区分相差 100bp 的 DNA 片段。为了满足特殊的要求，可选择低溶 点琼脂糖(<70C低于双链DNA的变性温度)。3 材料3.1 琼脂糖， 10mg/ml 溴化乙锭， 1kb DNAmar

10、ker3.2 100ml 50 TAE 缓冲液：Tris 24.2g冰乙酸 5.71ml, 0.5mol/L EDTA(PH6.8) 10ml3.3 6 Xh样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油3.4 枪头，移液器，锥形瓶，微波炉，制胶槽，梳子，水平电泳仪，稳压器， 凝胶成像系统4 操作步骤：4.1 将胶模槽放于水平工作台上。4.2 用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。 熔化琼 脂糖溶液冷却至60度时，加入浓度为0.5卩g/m溴化乙锭10ul,充分混匀。4.3 在胶模放置好梳子后，将具有一定温度的凝胶倒入胶模中，凝胶的厚度 在 3-5mm 之间。注

11、胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。4.4凝胶凝固后通常需要在室温中放置 30 45min，小心移去梳子，并将 凝胶托盘放入电泳槽。 可同时制作几块凝胶， 待其固化后用保鲜纸包住以防水分 挥发，置 4 度保存，通常在数日之内可以使用。4.5加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1 2mm，样品孔内有气泡，用吸管小心吸去，以免影响加样。4.6 将样品与上样缓冲液混合：上样缓冲液不仅能提高样品的密度，使样 品均匀沉到孔底，还可使样品带色，便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。4.7 用微量移液器将样品依次加在样品孔内。4.8盖上电泳槽并通电，5V/cm2,恒压电泳，使DNA向阳极方向移动。4

12、.9 电泳完成后切断电源，取出凝胶。如果凝胶中加有溴化乙锭，可直接在紫外透射灯下观察，否则就将凝胶浸泡在0.5微克/ml溴化乙锭缓冲液中浸泡3045min。4.10 用凝胶分析系统直接观察并拍照。5. 注意事项：5.1 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，并可对着光线肉眼检查凝胶溶 解情况，使附着在壁上的颗粒完全溶解。5.2 在微波炉上加热时间不要过长，以免引起暴沸。如蒸发过多的溶液，应补充部分缓冲液5.3 气温较高或用低熔点、低浓度（小于 0.5%）琼脂糖制胶、倒胶和电泳 时，最好在4°C进行。6. 结果观察6.1 仔细观察 DNA 泳动的方向。6.2 DNA 电泳结束后，记录正常组

13、与 marker 组电泳条带的相应位置。7.书写实验报告实验五 DNA 限制内切酶技术1. 原理：限制性内切酶 （即限制性核酸内切酶， 简称限制酶或内切酶） 是一类能识别 双链分子中特异核酸序列的水解酶，这类酶的发现和应用，促进了基因工程和 DNA 序列测定以及基因诊断技术的发展。它的应用是当代分子生物学研究最基 本、最重要的技术手段。从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子，必须经过酶切、 电泳分离、回收基因片断，方可用于重组或探针标记。根据酶切的目的不同，可 采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。2实验材料2.1 质粒 SNAT1-PBK-CMV /（600ng/ul, 150ul

14、）2.2 限制性内切酶 EcoRI2.3 1kb DNAmarker2.4 离心管,枪头,移液器,离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳所需材料3. 小量酶切反应体系本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。典型的反应是20卩1体积中含0.2 1卩gDNA酶切反应体系如下：质粒DNA5卩110缓冲液1卩1限制酶（根据质粒酶切位点选择）1卩1双蒸去离子水3卩1总体积1014. 操作方法4.1在一灭菌的新的Ep管中加入3卩双蒸水。4.2加入10 缓冲液1卩。4.3加限制酶1卩。4.4最后加入质粒DNA 5卩。4.5 稍离心，混合。4.6 37C 水浴 1 1.5h。4.7取出后电泳分析鉴定是否酶解。5. 注意事

15、项5.1 双蒸水为可变体积，当其他反应成分的量确定后，用双蒸水将反应体 积补足。5.2 质粒 DNA 最后加入，以防止操作不当引起试剂的污染。5.3 为保持限制酶的活性，将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎 冰中冰浴，操作应迅速，用后立即放回低温冰箱中。5.4 大多数酶多以浓缩液存放，吸取时需严格取量。若要取用多种酶，每 种酶必须单独使用吸头，避免交叉污染。5.5大多数限制酶均加50%甘油缓冲液置于-20E保存，其活力稳定，但在 配制反应混合物时， 酶的加入量要准确限制小于体积的 1/10，否则甘油会抑制酶 解反应。5.6 如欲节省酶的用量，可增加酶解时间，但酶解时间过长，易出现异常 条带

16、。5.7 当样品加入反应管之后，必须将装酶试管盖盖严，避免温育时水蒸汽 进入管内。6. 结果观察6.1 DNA 分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。仔细观察条 带数量。6.2. 与 Marker 对照，观察各条带中的 bp 数。6.3. 书写实验记录并画图记录各条带的位置。实验六 PCR 技术1. 原理：PCR 技术实际上是一个在模板 DNA 、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况 下，DNA聚合酶依赖的酶促反应，扩增的特异性取决于引物与模板 DNA的特异 结合。整个扩增过程分为三步：变性：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而 形成两条单链；退火：突然降温后，模板 DNA与引物按碱基配对的

17、原则互补 结合。也存在 2 链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要结 合发生在模板与引物之间； 延伸：在DNA聚合酶及镁离子存在时，从引物的 3'端开始、结合单核苷酸，形成与模板互补的新的 DNA链。上述三步为一个循 环，理论上讲，每经过一个循环，样本中的 DNA 量应该增加一倍，新形成的链 又可成为下一轮模板链循环的模板， 经过 25-30 个循环后 DNA 可扩增 106-109 倍。2. 操作方法针对本次实验的实验材料，体系和条件如下：PCR 产物约 800bp(一) 材料：2XTaq聚合酶：康为世纪模板：GFP-SNAT2-pBK-CMV / (56ng/ul)上游引物： 12.5uM， 35ul( 5，-3，CGTAATATTAGCGCGCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGG ) 下游引物： 12.5uM， 35ul( 5，-3，CGTACATATGCGCGCCACTTTATGCTTCCGGCTCGTATG )(二) 10ul 体系：ddH2O：2.36ul2XT