难得的Quantity One 软件的培训说明哦-Gel Doc XR ChemiDoc XRS 培训教程

1、凝胶成像及Quantity One初级安装培训大纲第一部分 仪器清点及软件安装简介：GelDoc XR和ChemiDoc XRS是Bio-Rad凝胶成像家族的两个成员，它们的特点是操作简便、功能齐全。它们采用自动控制的光学透镜CCD摄像头，便于进行缩放、聚焦和光圈大小等的调节，以实时采集图像。高精度的12位CCD使图像数据达到4096级灰度，能满足普通实验室各类凝胶以及印记膜的成像需求。除此以外，ChemiDoc XRS的CCD是一个可冷却45的超冷CCD，特别适合于化学发光等微弱信号的检测。Quantity One是凝胶成像仪附带的图像分析软件，并且可以直接控制这些仪器。拍好的图像直接通过Q

2、uantity One打开，可以灵活地实现蛋白及核酸的一维电泳凝胶分析以及聚类分析、克隆计数等，并可轻松实现各种分析结果的输出。仪器清点： Bio-Rad Quantity One软件应用讲义选配件：170-7950 White Light Transilluminator 或 170-8001 White Light Conversion ScreenPC要求：仪器安装：(详见工程师安装手册)1. 检查电源2. 按要求连接仪器，安装操作系统和图像采集卡（ChemiDoc XRS的图像采集卡要等到驱动程序安装完成后再插入）。3. 安装驱动程序（ChemiDoc XRS的图像采集卡要等到驱动程序

3、安装完成后再插入）。4. 安装Q1软件5. 运行Q1软件，生成Dark Reference6. 运行Q1软件，检查zoom，focus，iris 工作是否正常，滤光片位是否正常7. 用荧光标尺或荧光板，检查图像仪能否正常摄取图像8. 获取System ID9. 将System ID和软件序列号记下，同时提交软件密码注册表，用户用英文填写（名称要用全称）好后带回或由用户按表中所示传真回公司。仪器各组成部分和功能介绍图像采集 （荧光chi）注意事项：1 安装ChemiDoc XRS的图像采集卡时，要先安装其驱动程序，再将图像采集卡插入；2 如果软件的密码狗不能被正常识别，请安装带补丁的驱动程序或向

4、Bio-Rad安装工程师求助；3 在给用户安装图像仪和软件前，先提醒用户保存好申请来的密码、软件序列号和密码狗。4 培训仪器时，提醒用户不要将潮湿的样品长期放在暗箱内，以防腐蚀滤光片，更不要将液体溅到暗箱底板上，以免烧坏主板。5 提醒用户仪器用完，及时关上电源，特别是ChemiDoc XRS的CCD电源；6 提醒用户勿用控制成像仪的电脑上网，也不要自行重装电脑操作系统或给操作系统升级。第二部分 图像获取及Quantity One软件分析操作培训目的：1 熟练掌握凝胶成像仪对一维电泳凝胶图像的获取；2 熟悉用ChemiDoc XRS对印迹膜的化学发光检测；3 熟悉Quantity One的定量分

5、析和条带分析流程。时间安排：成像仪的使用培训大约需要2040分钟，Quantity One软件培训时间大约为1小时。第一章 简介凝胶电泳是每个做分子生物学的研究者天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，今天要向大家介绍的是Bio-Rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。Quantity One软件是常用1D凝胶分析软件中功能最强大，自动化程度最高的软件。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的网站（http:/www.bio-）免费下载，以供试用或用户升级之用。

6、Quantity One软件的主要功能包括定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等，此外，还可以直接控制Bio-Rad公司的各类图像仪和ExQuest自动切胶仪，使您的凝胶分析工作变得极为轻松。Quantity One软件拥有与windows操作系统下绝大多数应用软件相同的友好界面。插入密码狗，打开Quantity One软件，可以看到最上缘蓝色横条幅是标题栏，往下依次是菜单栏和工具栏。每个菜单的主要功能如

7、下：File图像打开、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、条带匹配分析Edit图像普通编辑操作Volumn定量分析View图像缩放、三维视图、看光密度值等操作Analysis浓度估算、克隆计数等分析Image图像旋转、翻转、裁切等操作Reports分析结果输出Lane泳道分析Window窗口分析Band条带分析Help帮助、快捷菜单、软件注册等 往下一行是工具栏，上面每个按钮的功能见下表：打开文件图像显示控制条带分析工具保存操作显示条带匹配工具打印图像去除分析标记轮廓修改工具看全图图像工具打印快捷指南局部放大文字工具定量分析快捷指南拖曳定量工具条带分析快捷指南放大并居中灰度分析工具克隆

8、计数快捷指南缩小并居中泳道分析工具Quantity One软件HelpàQuick Guide快捷指南提示如何实现一个功能，如定量分析(Volumes Quick Guide)，电泳条带分析(Band Analysis)，差显分析(Differential Display Analysis)，克隆计数(Colony Counting Analysis)等。快捷指南下有1，2，3步骤，根据提示完成。使用Quantity One软件进行电泳结果分析，通常包括图像获取、图像预处理、分析、结果输出四部分。图像获取就是通过软件控制扫描仪（GS-800、PharosFX等）或凝胶成像系统（Gel

9、Doc、ChemiDoc、VersaDoc等）图像预处理就是将扫描或拍照获得的原始图像进行初步处理，以便更好地进行后续分析。接下来是分析过程，根据分析的方法和目的不同，又可以分为定量分析、条带分析、克隆计数、差异（聚类）分析等等。不管如何分析，最终我们都必须通过软件的输出功能，得到我们想要的结果。Quantity One软件提供了多种结果输出方式。在接下来的几章里，我们将按照这个思路，一步步引导您使用这一软件。第二章 图像获取Quantity One 4.44.6版本可以控制Bio-Rad目前几乎所有的图像仪，如GelDoc XR、ChemiDoc XRS等。这些图像仪采集到的图像，可以直接保

10、存成软件可直接分析的图像，即扩展名1sc的原始图像文件。下面将具体介绍如何通过Quantity One软件从GelDoc XR和ChemiDoc XRS获取图像。一 GelDoc XRGelDoc XR是Bio-Rad凝胶成像系统中最常用，操作最简便的仪器，它可以用来拍摄EB、SYBR Green等染料染的核酸电泳凝胶；Sypro Ruby、银染、考马斯亮蓝等方法染的蛋白电泳凝胶；以及化学显色的印记膜等。使用GelDoc XR之前，先接通电源，打开位于仪器背面右下角的电源开关；然后根据具体的应用选择合适的照明和滤光片位置。原则如下：表格形式模式1. 如果样品是通过EB、SYBR Green、S

11、ypro Ruby等染料通过紫外激发来显色，就先将样品置于紫外透射平台(UV Transilluminator)的中间，关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans UV”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。模式2. 如果样品是通过金属银、考马斯亮蓝等染料染色，就先将白光转换屏 (White Light Conversion Screen)取下，打开下部的开关，放在紫外透射平台上，样品置于白光转换屏中间。关上暗箱门，然后按下面板上的“Trans White”按钮，并将滤光片选择杆置于位置“I”处。模式3. 如果是化学显色等非透明可见样品，则用模式2中所示方法，将样品置于白光转换屏中间。关上暗箱

12、门，然后按下面板上的“Epi White按钮”，并将滤光片选择杆置于位置“O”处。接下来打开Quantity One软件，选择FileGelDoc XR，按以下顺序操作： 按下Live/Focus，成像仪进入实时成像； 选择照明模式，一般核酸胶用UV,蛋白胶用White模式 注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮 此功能有三个上下键按钮：IRIS（光圈），ZOOM（缩放），FOCUS（聚焦），您可在软件上直接调节或在仪器面板上手工调节 调节步骤：a 调大IRIS，以看到图像 b点ZOOM,将胶适当放大 c 调节IRIS至合适大小（一般情况下尽量选择小光圈，因为小光圈景深大，图像更清

13、晰) d调节FOCUS，至图像最清晰按 按“Auto Expose”；如是，单击Auto Expose,系统将自动选择曝光时间成像，如不满意，单击Manual Expose，并输入曝光时间（秒），图像满意后保存; During the auto exposure, the image is continuously integrated on the camera CCD until it reaches a certain percentage of saturated pixels. This percentage is set in the Options dialog box. (De

14、fault = 0.15 percent. See section B.9, Options.) Once you are satisfied with the quality of the displayed image, click on the Freeze button to stop the exposure process. The last full exposure will be displayed in the image window. 如是蛋白凝胶，接第6步直接将清晰的图像保存即可 按下“Analyze”；AnalyzeClicking on Analyze will

15、open a separate image window displaying the captured image. The default name for the image will include the date, time, and user (if known). 按下“Save”键，保存图像。二 ChemiDoc XRSChemiDoc XRS是Bio-Rad另一款常用的凝胶成像仪，它不仅具有GelDoc XR的全部功能，而且还有卓越的化学发光检测功能。它配备一个功能强大的超冷CCD，具有很高的灵敏度，能检测微弱的Western Blot化学发光信号。ChemiDoc XRS

16、的操作与GelDoc XR类似，主要的不同在于操作者需要首先选择要拍摄的样品类型(Select Application)，软件会自动调整数据采集模式。用户还可以根据自身样品的特殊性选择适当的照明模式和像素捆绑 即binning，有2×2、3×3两种捆绑水平，2×2代表长宽共4个像素采集的信号绑在一起，3×3代表长宽共9个像素采集的信号绑在一起。捆绑的像素越多，灵敏度越高，但分辨率相应降低。这项功能主要适用于化学发光检测。水平。接下来打开Quantity One软件，选择FileChemiDoc XRS，按以下顺序操作： 选择合适的应用模式，鼠标点击会弹出

17、如下图所示的菜单：a) 核酸凝胶或荧光染色的蛋白胶，选择UV Transilluminationb) 银染、考染的蛋白胶，选择White Transilluminationc) 不透明、不发光样品，选择White Epi Illuminationd) 信号较强的化学发光印记膜，选择Chemiluminescencee) 信号较弱的化学发光印记膜，选择Chemi Hi Sensitivityf) 如果要拍照特殊样品，如信号很弱的化学发光印记膜，选择Custom，并选择需要的照明方式及像素捆绑等；注意，选择完成后，要按下成像仪面板上相应的光源按钮，同时根据以下原则调整滤光片位：在a、b两种应用模式

18、下，或在custom模式并选择紫外或白光透射时，将滤光片选择杆置于位置“I”处；其它模式或在custom模式并选择侧面白光或无照明时，将滤光片选择杆置于位置“O”处。 对焦，调节光圈，方法与GelDoc XR类似； 调节好以后，按下“freeze”； 获取图像，非化学发光检测，选择自动曝光或手动曝光；化学发光检测选择“Live Acquire”，弹出如下对话框：第一行，填入最长曝光时间（以秒为计）；第二行，填入初次曝光时间（以秒为计）；第三行，填入需要曝光的次数，每次曝光都是前几次曝光时间的累加最后按“OK”键，开始曝光。注意：化学发光检测需要关闭所有光源，并将光圈“IRIS”调至最大。另外，

19、建议先用检测普通非透明样品的方法对焦，再关闭光源，检测化学发光 当这个选项被选中时，对于步骤当中的a)、b）两种应用模式，曝光完成后软件会提示是否需要重新做平场。如果要做，按软件提示一步步做下去即可，如果不久前做过，可选择不做。1 如是化学发光，在Select Application下选择Chemiluminescence 或Chemi Hi Sensitivity(如样品强度较弱)，先打开Epi-White侧面白光，同第5步调节清楚膜的聚焦状态（如膜上没有可对焦的标记，可用记号笔做个小记号）。然后关闭光源，不打开任何光源，将滤光片位置换到o位（仪器上方右侧），将光圈Iris开到最大，选择Au

20、to Expose自动曝光，或输入Manual Expose时间，可对化学发光的弱信号进行长时间积累如30min，或单击Live Acquire进行多桢图象实时采集，在对话框内定义曝光时间长短，采集几桢图象，在采集的多桢图象中选取满意的保存。 化学发光是特别弱的发光，所以曝光可以很长，记得做完化学发光后，把滤光片位置换到原先的位置（I位）Illumination Flat Fielding第三章 图像分析Quantity One的图像分析功能相当强大，根据不同的需要，可以分为定量分析、条带分析、相似性分析以及克隆计数(用于蓝白斑筛选)等等，而且每种分析法都有独特的优点和输出方式。本章重点介绍常

21、用的定量分析和条带分析方法，其余更细更深的功能请参考软件自带的用户手册。一 定量分析（Volumn Analysis）定量分析是计算选定区域内信号强度的总和，是Quantity One最方便的定量工具。这种分析方式考虑全定区域的真实形状，可用于电泳条带、斑点、大型芯片以等图像的定量。这种定量的方法可以扣除背景，可以按照用户的标准曲线计算出条带或斑点的浓度，但它不能计算分子量，也不能进行条带匹配和相似性分析。Quantity One软件称这类定量的结果为Volume。 Volume选定区域内所有像素信号强度的总和×像素面积 Volume的单位：int×mm2快捷指南Volum

22、es Quick Guide，能够指导您对任意所选区域进行定量分析,此分析可以报告多种结果，常用的结果是相对浓度和绝对浓度（须提供标准品）。具体的操作方法如下：1 选择成像系统或打开已保存的文件(软件可以控制Bio-Rad所有的成像系统如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 必须是8位（bit）或16位（bit）无压缩的tiff文件文件格式，软件也可进行分析处理)2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 Transform转化，调节图象的对比度黑白4 选择待分析区域：Volumn Conto

23、ur Tool等高线勾勒区域，自动连接浓度浓度相同的点，如U1 Volume Free hand Tool自由画笔选择区域，可以勾勒出无规则形状,如U2Volume Rect Tool 矩形区域选择，如U3Volumn Circle Tool圆形选择区域，如U4按上面4种方法选择需要定量的区域。5双击所选区域，出现如下窗口，定义样品类型，如未知样品Unkonwn(U1,U2即待计算样品)，背景Background(B1,B2，软件在算浓度时会将此区域的浓度自动扣除) 或标准样品Standard（Std1,Std2, 如果该样品是浓度标准样品，即定量标准，需在浓度concentration一栏输

24、入该样品的浓度）。6 Select Tool选择不同区域7 Print Image打印图像8 Volume Analysis Report 定量报告结果，打开出现如下窗口，选择要报告的参数，主要有2个参数Volume、adj. Vol. (即adjusted volume) 和Concentration。Volume为定量值，adj. Vol. 为扣除背景后的定量值，如有浓度标准样品（Std），软件可报告Concentration绝对浓度。参数选好后，按下按钮“done”。 7软件报告如下图所示：按右侧输出按钮，可将表格保存成txt文件，按左侧打印按钮，可将报告打印出来。打印文本输出二条带分析

25、（Band Analysis）条带分析是Quantity One最基本的分析工具，它可以自动识别电泳泳道和识别条带，依据泳道的平均光密度和条带宽度对每个条带进行模式化定量。这种分析方式虽然不如定量分析来得方便，但这样可以实现非常复杂的电泳分析，满足各种不同的结果需要。这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素而进行全自动定量。用条带分析的方法进行定量的结果叫Trace Quantity（Trace Qty），计算方法是：首先软件自动计算条带上每一横排像素的平均光密度和平均光密度分布曲线，然后每个具体条带的定量值是平均光密度曲线的线下面积的积分，即：Trace Quantity平均光密度&

26、#215;条带上下边界的距离Trace Quantity的单位：OD*mm条带分析中的条带定量模型下面介绍用此功能对泳道内的所有条带进行分子量确定，相对浓度分析1 打开已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系统所摄取的图象，将图象保存为Tiff 必须是8位（bit）或16位（bit）无压缩的tiff文件文件格式，软件也可进行分析处理)2 Zoom Box，缩放，对图象进行放大观察3 Transform转化，调节图象的对比度黑白4 确定泳道(lane),并对泳道进行各种调整（实际实验中泳道往往不是垂直的而出现各种变形）。按下图所示在软件的工具栏中有一Lane Tool图标，包含有更多泳道编辑工具

27、。Band Tool条带编辑工具包Lane Tool泳道编辑工具包5选择Frame Lanes，输入图像实际泳道(lane)数并确认。此时图像上泳道的位置上会出现一条条红线，每条红线就代表一根泳道。6选择Add/Adjust Anchors，此时泳道红线上会出现一些小圆圈。这些小圆圈称为锚定点(anchor)，锚定点规定了泳道走向。当泳道不直时，点击出现弯曲的泳道部位，就可以增加锚定点。鼠标按住锚定点，可以拖动锚定点，让每根红线始终位于泳道的中间线上。7Lane Background去除泳道背景。点击该按钮，选择一条适当的泳道点击之，然后在弹出的对话框中选“All Lane On”，在“Rol

28、ling Disk Size”中填入适当的数值 数值代表背景扣除数，值越大则背景扣除越少，被计入条带定量值越多，反之则背景扣除越多。从经验来看，该数值以240之间为宜。 8Detect Band，检测泳道内的条带，打开出现如下窗口。通过调节sensitivity灵敏度可调节检测出的条带数，调节Lane Width使代表表带的红色横线与条带宽度差不多宽。中间一行人工编辑按钮可以用来增加/减少条带、调节条带的上、下边界等。打开工具栏中Band Tool条带编辑工具包可看到更多编辑工具（如上图）人工编辑按钮9. Standard输入分子量标准，软件自带有许多Bio-Rad的分子量标准，如你用的是自己

29、的标准，进入New Standard建立新的分子量标准，软件可以选择标准单位是MW（蛋白质）还是BP（核酸）等（左下图）。在Protein-Standard对话框中输入分子量数值，完成后单击赋值图标（右下图），回到图象文件上单击标准样品的泳道，软件自动将所输的分子量数值和泳道内的条带一一对应。赋值图标：告诉软件哪条是分子量标准样品的泳道输入分子量数值10. Band Attribute条带属性，在完成第9步以后，软件已自动计算出了其他未知条带的分子量,打开band attribute选择要报告的参数，这里我们选择Molecular Weight，图象上可以看到所有条带的分子量（红颜色标记），标准分子量为蓝色标记。11. Print Image打印图象12. All Lane Report所有泳道条带结果报告。打开窗口，选择要报告的参数，如Mol.Wt.（分子量，如左下图），软件将报告结果（右下图），在报告的右下脚有一报告输出工具，点击可将报告结果输出成TXT文本格式或输出至剪贴板，可粘贴到EXCEL，WORD等文件下。报告结果输出条带%常见问