血小板对溶液渗透压变化耐受能力的测定及其意义

1、血小板对溶液渗透压变化耐受能力的测定及其意义    摘要 为了测定血小板对溶液渗透压变化的耐受能力,将等渗条件下新鲜血小板置于47nbsp;-nbsp;611nbsp;mOsm的系列晶体盐溶液中15nbsp;分钟,然后恢复至等渗。测定对应渗透压溶液处理后及其恢复至等渗后血小板磷脂酰丝氨酸(PS)nbsp;阳性率和CD62pnbsp;阳性率。结果     欧阳锡林,刘景汉,高大勇 摘要为了测定血小板对溶液渗透压变化的耐受能力,将等渗条件下新鲜血小板置于47 - 611 mOsm的系列晶体盐溶液中15 分钟,然后恢复至

2、等渗。测定对应渗透压溶液处理后及其恢复至等渗后血小板磷脂酰丝氨酸(PS) 阳性率和CD62p 阳性率。结果表明,当渗透压低于224 - 238 mOsm 时血小板CD62p 和PS 阳性率显著增高,已有部分血小板被激活;当渗透压不超过611 mOsm时血小板仍然没有明显的激活。不同渗透压溶液中的血小板恢复至等渗状态时血小板CD62p 和PS 阳性率没有明显增加。结论:血小板对低渗溶液敏感而能耐受较高的晶体渗透压;晶体溶液对血小板的渗透损伤本质可能是超出血小板安全体积限度。    关键词血小板; 渗透压; 晶体盐溶液   &#

3、160;中图分类号R457. 1 文献标识码A      Determination of Tolerance Ability of Platelet to the Change of Solution Osmotic Pressure and Its Signif icance      OUYANG Xi2Lin , LIU Jing2Han , Dayong GAO1 ,2    Department of Blood Transfusion , T

4、he general Hospital of PLA , Centre for Clinic Blood Transfusion Medicine of PLA , Beijing 100853 , China ;1 Institute of Cryobiomedicine , Faculty of Thermal Science and Energy Engineering , Science and Technology University of China , Hefei 230027 , China ;2 University of Kentucky , Lexington , Ke

5、ntucky 40506 USA    Abstract In order to determine the tolerance ability of platelet to change of osmotic pressure in solution , the isotonic fresh platelets were exposed to a series of crystal salt solutions with osmotic pressure range from 47 to 611 mOsm for 15 minutes. Then th

6、e plateletswere returned to isotonic condition and kept for 15 minutes. The expressions of phosphatidylserine and CD62p were assayed in platelets. The results showed that the phosphatidylserine and CD62p expressions were increased when the osmotic pressure of solution was below 238 mOsm , but no sig

7、nificant rise was detected when the platelets were exposed to 611 mOsm solution. No increases of positive rate of CD62p and phosphatidylserine were detected in platelets returned to isotonic condition. It is concluded that platelets are sensitive tohypoosmotic solution and tolerated to hyperosmotic

8、solution. Exceeding the platelet safe volume limitation may lead to injure of platelet osmosis in crystal salt solution.    Key words platelet ; osmotic pressure ; crystal salt solution    血小板冰冻保存的降温和复温过程,其实质是血小板胞膜内外渗透压变化所引起的一系列复杂的传热和传质过程1 。血小板膜对水和冰冻保护剂的渗透特性是决

9、定降温、复温技术对血小板的安全性的重要因素,也是血小板冰冻保存成败的关键所在。我们研究溶液渗透压及其渗透经历对血小板的安全性限度,探讨其应用于指导建立理想的血小板冰冻保存技术中的意义。     材料与方法      材料    主要仪器晶体渗透压计,FACSCalibur 流式细胞仪(Becton Dickinson) 和CELLQuest 分析软件。主要试剂NaCl ,双蒸水,改良Tyrode 缓冲液(NaCl137 mmolPL , KCl 2. 8

10、mmolPL , MgCl2 1 mmolPL , NaH2CO3 12 mmolPL , HEPES 10 mmolPL , NaH2 PO4 0. 4mmolPL , D2glucose 5. 5 mmolPL pH 7. 4 , TBS)血小板来源取自无偿献血者,献血前1 天内没有饮含酒精类饮料,2 周内没有服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的任何相关药物;没有可检测的出、凝血性疾病。取8份新鲜血小板标本,在测定之前放      方法    不同渗透压溶液的配制以等渗的TBS 为基础,加入蒸馏水或NaC

11、l ,配制112 - 611 mOsm 不同渗透压的系列溶液。然后,根据溶液配方配制对应的等渗恢复溶液。所配制溶液的实际晶体渗透压采用冰点法测定。    不同渗透压下及其恢复等渗后血小板磷脂酰丝氨酸(PS) 阳性率和CD62p 阳性率的测定将恒温金属浴温度设在22. 0 。将一系列低渗、等渗和高渗溶液按渗透压从低到高排列,取某渗透压的溶液0. 5ml 于容积为1. 5 ml 的Eppendorf 管中盖好,置于恒温金属浴中恒温15 分钟;然后在每管加同一人份的新鲜血小板30l ,混匀后继续孵育15 分钟;取溶液30l ,测定血小板CD62p 阳性率和PS

12、 阳性率2 。再加入22. 0 孵育过的相应的TBS 0. 5 ml 或相应体积的蒸馏水,迅速颠倒混匀,恢复到等渗,继续孵育15 分钟后,取溶液30l ,测定血小板CD62p 表达和PS 阳性率。      结果    不同渗透压处理的血小板PS 和CD62p 表达率的变化在低渗溶液中,当渗透压低于224 - 238 mOsm 时血小板CD62p 和PS 阳性率显著增高,已经有部分血小板被激活(图1 A 和B 左侧部分) ;在高渗溶液中,当渗透压不超过611 mOsm 时血小板仍然没有明显的激活(图1 A

13、 和B 右侧部分) 。不同渗透压溶液中的血小板恢复至等渗状态时血小板CD62p 和PS 阳性率没有明显增加(图1 A 和B 与a 和b) 。    不同渗透压处理后血小板侧向散射光变化经过低渗处理再恢复到等渗后血小板出现一群散射光明显降低的亚群(图2 A 和B) ,部分血小板胞内颗粒度明显降低,形态发生显著改变;而经过高渗透压处理再恢复到等渗时血小板并不出现新亚群(图2 B 和C) 。      讨论    血小板冰冻保存技术,通过近40 年的经验性研究后,人们逐渐

14、从经验式转向理想的血小板深低温保存技术的研究,其成功的关键在于测定血小板的低温生物学和物理学特性参数,然后根据具体参数设计理想的血小板冰冻保存技术3 ,4 。细胞膜对水和冰冻保护剂的渗透特性决定了冰冻保存的降温速率和所需要的冰冻保护剂的类型及浓度。血小板对溶液渗透压变化的耐受能力决定保存和洗涤血小板所使用溶液的渗透压跨度安全范围及技术方案的设计。所以血小板胞膜渗透特性参数是血小板最重要的低温生物学特性之一5 ,6 。    Figure 1 PS and CD62p expressions of platelets in solution with va

15、rious osmotic pressures and then returning to isotonic solution.A :Platelets CD62p expression in solutions with various osmotic pressures. B: Platelets PS expression in solutions with various osmotic pressures. a : Platelets CD62p expression when returning to isotonic solution. b : Platelets PS expr

16、ession when returning to isotonic solution(略)    Figure 2 Schematic of side scatter light analysis of platelets in hypotonic , isotonic or hypertonic solution , respectively. A : Platelets in 210 mOsm solution. A new subpopulation with low side scatter light generated from fresh

17、platelet. B:Platelets in286 mOsm solution. C :Platelets in 502 mOsm solution(略)    由于血小板胞内外渗透压的变化,水可以进行快速自由交换,而晶体盐离子如Na + ,K+ 和Cl - 则不能自由通过。当血小板胞膜完整时悬浮于等渗血浆或晶体盐溶液中的新鲜血小板胞内总溶质处于某一定量,胞内物质的交换主要表现在水的交换。    当血小板进入低渗溶液时胞外的水进入细胞内,血小板膨胀,超过一定限度就被激活。当溶液被恢复到等渗时,没有破裂的血小板胞

18、内溶质不变,血小板体积将恢复到原来的水平,此时血小板激活率未见明显增加。从图2 A 和B 以看出,血小板存在不同的群体,对低渗的耐受能力并不相同。随着溶液渗透压的降低,气球样血小板(balloon2like plate2let) 比例逐渐增高。    当等渗溶液中的血小板进入高渗溶液中时,血小板皱缩,体积缩小,但不会超过其保留体积。当胞外溶液渗透压高到一定程度时,缩小的血小板受到溶质损害(即胞外微量溶质进入细胞内) ,造成恢复等渗时胞膜膨胀破裂。当胞膜完整的血小板从高渗恢复至等渗时由于胞内溶质总量不变,依然恢复至原来的体积。  

19、60; 结果表明,等渗溶液中的血小板对低渗透压溶液敏感,而能够耐受较高的渗透压,提示血小板对积膨胀敏感但能够耐受较大程度的皱缩。血小板在低渗条件下激活的特点是几乎同时表达CD62p 和PS。这与血小板在22 常规振荡保存时主要表达CD62p 的特点有所不同,其机理有待进一步研究。    血小板从不同的渗透压恢复到等渗条件,我们没有采用逐步添加的方式,而是一次加入后颠倒混匀。令人惊讶的是,血小板从不同渗透压快速恢复到等渗条件的过程(加入不同程度的高渗或低渗溶液,甚至蒸馏水) 并不增加血小板的激活。我们分析认为,在TBS 中没有添加可以渗透入细胞内

20、的溶质,在血小板进入高渗TBS 中时胞内水分减少发生皱缩而溶质总量并不增加;当血小板胞膜外介质恢复等渗时,虽然水快速进入细胞内,胞内在等渗时由于总溶质不变,从而体积增加不超过等渗时的体积,也就是说血小板没有膨胀。这一点与洗涤去除DM2SO 时的血小板胞内渗透压降低或血小板进入低渗溶液发生的情况不同,因为二者都造成血小板体积超过等渗时的容量。低渗溶液中血小板加入高渗溶液恢复至等渗时,只发生体积缩小,并试图恢复血小板原来的体积。血小板耐受渗透压变化能力的本质可能是血小板体积变化耐受能力。我们下一步将测定血小板体积变化与血小板激活之间的关系,即血小板安全体积变化范围。  

21、0;   结论    在等渗条件下的新鲜血小板进入其它溶液中时能够耐受的溶液低渗透压限度为224 - 238 mOsm ,耐受高渗的限度在611 mOsm 以上。也就是血小板对膨胀敏感而能耐受较大程度的皱缩。血小板耐受渗透压跨度变化能力的本质可能是血小板体积变化是否超出体积变化安全范围。      参考文献    1 Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood freezing. J Gen Physiol , 1963 ; 47 :347 - 369    2 欧阳锡林,刘景汉,骆群等. 流式细胞术联合测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62p. 中国实验血液学杂志, 2002 ; 10 :66 - 69    3 Reid TJ , Gao DY. Sympo