研究生--干细胞

1、1干细胞及其应用前景Stem Cells and Promise施海燕施海燕2干细胞的研究史干细胞的研究史1996年年7月月5日，苏格兰爱丁堡市郊日，苏格兰爱丁堡市郊的罗斯林研究所应用的罗斯林研究所应用细胞核转移技细胞核转移技术克隆术克隆了一头大个儿羊羔，了一头大个儿羊羔，伊恩伊恩威威尔默特尔默特以著名乡村歌手以著名乡村歌手多利多利帕顿帕顿的的名字命名这头羊。名字命名这头羊。 3细胞核转移技术细胞核转移技术试管婴儿试管婴儿4干细胞研究的意义何在？干细胞研究的意义何在？ 干细胞之所以引起世人瞩目，干细胞之所以引起世人瞩目，主要是因为主要是因为单性繁殖单性繁殖和和克隆克隆技术技术被过度宣传，但这绝

2、不被过度宣传，但这绝不是干细胞研究的主要方向，是干细胞研究的主要方向，目前的技术也根本达不到这目前的技术也根本达不到这个水平。并涉及个水平。并涉及伦理道德问伦理道德问题题。 5再生医学的必然性再生医学的必然性 再生医学再生医学是生命科学发展史上的是生命科学发展史上的一个必然的过程，年的一个必然的过程，年的生命科学发展在医学上造就了一生命科学发展在医学上造就了一个个左手拿刀，右手拿毒药左手拿刀，右手拿毒药，以对，以对抗生命的物质、对抗疾病的方法抗生命的物质、对抗疾病的方法来保障生命安全，其实这是非常来保障生命安全，其实这是非常矛盾的。这种方法本身不符合生矛盾的。这种方法本身不符合生命哲学的理论，

3、也不符合生命规命哲学的理论，也不符合生命规律，是律，是违背生命规律违背生命规律的。的。 6再生医学的概念再生医学的概念 广义上讲，广义上讲，研究如何促进创伤与组织器官缺损生理性修研究如何促进创伤与组织器官缺损生理性修复以及如何进行组织器官再生与功能重建。复以及如何进行组织器官再生与功能重建。可以理解为可以理解为通过研究机体的正常组织特征与功能、创伤修复与再生通过研究机体的正常组织特征与功能、创伤修复与再生机制及机制及干细胞分化机理干细胞分化机理，寻找有效的生物治疗方法，寻找有效的生物治疗方法，促进机体自我修复与再生，或构建新的组织与器官以维促进机体自我修复与再生，或构建新的组织与器官以维持、修

4、复、再生或改善损伤组织和器官功能。持、修复、再生或改善损伤组织和器官功能。 狭义上讲，是指利用生命科学、材料科学、计算机科学狭义上讲，是指利用生命科学、材料科学、计算机科学和工程学等学科的原理与方法，和工程学等学科的原理与方法，研究和开发用于替代、研究和开发用于替代、修复、改善或再生人体各种组织器官的定义和信息技术，修复、改善或再生人体各种组织器官的定义和信息技术，其技术和产品可用于因疾病、创伤、衰老或遗传因素所其技术和产品可用于因疾病、创伤、衰老或遗传因素所造成的组织器官缺损或功能障碍的再生治疗。造成的组织器官缺损或功能障碍的再生治疗。 7干细胞分化干细胞分化 生理意义：生理意义：每天人的细

5、胞都在活动，每天人的细胞都在活动，器官也在活动，每一天都有凋亡、损器官也在活动，每一天都有凋亡、损伤和坏死，但是每一天都有细胞再生伤和坏死，但是每一天都有细胞再生来及时补充。这个过程有一些是很明来及时补充。这个过程有一些是很明显的，像显的，像皮肤、粘膜、口腔皮肤、粘膜、口腔等等每天等等每天都在变化，当然这个变化包括都在变化，当然这个变化包括毛发毛发也也是一样，是一个动态过程。是一样，是一个动态过程。 病理意义：病理意义：现在已经发现，癌症、糖现在已经发现，癌症、糖尿病、帕金森综合症等一系列免疫系尿病、帕金森综合症等一系列免疫系统、神经系统疾病都可能是统、神经系统疾病都可能是干细胞变干细胞变异异

6、引起的。引起的。 8干细胞的概念干细胞的概念 所谓干细胞（所谓干细胞（Stem Cell，SCs）是一）是一类具有类具有自我更新自我更新和和分化潜能分化潜能的细胞。的细胞。 它包括胚胎干细胞和成体干细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。 它它能产生特异的细胞类型能产生特异的细胞类型，形成人体的，形成人体的组织和器官。组织和器官。 干细胞的发育受多种内在机制和微环境干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。因素的影响。 9干细胞干细胞 概念、概念、分类、特点分类、特点 人胚胎干细胞人胚胎干细胞 间充质干细胞间充质干细胞 成体干细胞成体干细胞10全能干细胞（全能干细胞（Totipotent SC

7、s） 从探讨从探讨受精卵受精卵的发育开始，受精卵既然的发育开始，受精卵既然可以变成可以变成一个个体一个个体，也就是变成人类所有的细胞，所以我，也就是变成人类所有的细胞，所以我们称们称受精卵具有全能性受精卵具有全能性。 实际上实际上孪生双胞胎孪生双胞胎，就是受精卵在一分为二的时，就是受精卵在一分为二的时候，失去彼此间的联系，然后各自又发展出完整候，失去彼此间的联系，然后各自又发展出完整的个体，所以孪生双胞胎会长得一模一样。的个体，所以孪生双胞胎会长得一模一样。 事实上，受精卵由一变为二，二变为四，四变为事实上，受精卵由一变为二，二变为四，四变为八的过程中，这八的过程中，这八个最初的细胞都还具有全

8、能性八个最初的细胞都还具有全能性。 11受精卵具有全能性受精卵具有全能性12全能干细胞全能干细胞多能干细胞多能干细胞单能干细胞单能干细胞13多多能能干干细细胞胞14全能干细胞全能干细胞多能干细胞多能干细胞15多能干细胞多能干细胞 一九九五年，美国禁止政府以经费资助人类胚胎的研究一九九五年，美国禁止政府以经费资助人类胚胎的研究和应用，不过私人的生技公司仍持续投入经费，和应用，不过私人的生技公司仍持续投入经费， 一九九八年十一月一九九八年十一月多能干细胞在实验室中存活：多能干细胞在实验室中存活： 汤姆森（汤姆森（James Thomson）博士从人工受精诊所得到胚）博士从人工受精诊所得到胚胎，这些

9、胚胎原本是不孕症父母预备用来繁殖后代的，胎，这些胚胎原本是不孕症父母预备用来繁殖后代的，由于准备得较多，手术后有剩余，本来将被销毁。但在由于准备得较多，手术后有剩余，本来将被销毁。但在得到捐赠者的同意之后，研究人员由这些得到捐赠者的同意之后，研究人员由这些胚胎内部的十胚胎内部的十六个细胞六个细胞中，得到了多功能的干细胞。中，得到了多功能的干细胞。 科学科学1998 吉尔哈特（吉尔哈特（J. Gearhart）博士则是从医院得到合法堕胎）博士则是从医院得到合法堕胎的胚胎，他从原本会发育成的胚胎，他从原本会发育成睪睪丸或卵巢的区域取得丸或卵巢的区域取得原始原始生殖细胞生殖细胞，也具有多功能干细胞的

10、特性。，也具有多功能干细胞的特性。 美国国家科美国国家科学院院报学院院报(PNAS)1998 16多能干细胞多能干细胞17多能干细胞多能干细胞 一直到变为一直到变为三十二个细胞三十二个细胞的时候的时候，其中十六个细胞，其中十六个细胞在外围，十六个细胞在内在外围，十六个细胞在内部，在外围的细胞会发展部，在外围的细胞会发展成胎盘等，在成胎盘等，在内部的十六内部的十六个细胞虽然没有办法变成个细胞虽然没有办法变成完整的个体，也就是失去完整的个体，也就是失去了全能性，但是他们还是了全能性，但是他们还是可以变成大部分的组织或可以变成大部分的组织或器官器官。像这样功能很多的。像这样功能很多的细胞，我们称为细

11、胞，我们称为多功能干多功能干细胞细胞。 胚胎干细胞胚胎干细胞 来自来自4-5d胚泡中的内细胞群胚泡中的内细胞群（inner cell mass，ICM） 胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞 从从5-10周胎儿生殖嵴的原生周胎儿生殖嵴的原生殖细胞中分离出殖细胞中分离出伦理道德的困惑！伦理道德的困惑！18诱导多功能干细胞（诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cell，又称，又称iPS细胞细胞） 2007年年11月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布成功将成功将人体皮肤细胞人体皮肤细胞改造成了几乎可以改造成了几乎可以和胚胎干细胞相和胚胎

12、干细胞相媲美的多功能干细胞媲美的多功能干细胞-“iPS细胞细胞”，由于绕开了胚胎干，由于绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，科学界对细胞研究一直面临的伦理和法律等诸多障碍，科学界对这种细胞表现出强烈的兴趣，纷纷制订相关的研究计划。这种细胞表现出强烈的兴趣，纷纷制订相关的研究计划。 这项技术的出现，可以对这项技术的出现，可以对人类发育的研究人类发育的研究不用再经过受不用再经过受精卵而进行，避免了伦理问题，同时，在对精卵而进行，避免了伦理问题，同时，在对新药的试验新药的试验上，也可以直接用人体干细胞进行试验，不用再通过动上，也可以直接用人体干细胞进行试验，不用再通过动物实验的环节，

13、毕竟人体和动物在代谢上有很大不同，物实验的环节，毕竟人体和动物在代谢上有很大不同，大约大约80%至至90%在动物实验中通过的药品，会在人体试在动物实验中通过的药品，会在人体试验中被淘汰。验中被淘汰。 1920iPS治疗镰状红细胞贫血治疗镰状红细胞贫血干细胞多能性维持机制干细胞多能性维持机制 2010年年4月月10日日生物化学期刊生物化学期刊(JBC) ，中国科学院动，中国科学院动物研究所和遗传发育研究所的研究小组在物研究所和遗传发育研究所的研究小组在国际上首次国际上首次发现发现并明确证实并明确证实决定小鼠（哺乳动物）干细胞多能性的关键基决定小鼠（哺乳动物）干细胞多能性的关键基因决定簇因决定簇位

14、于小鼠位于小鼠12号染色体的一个印记区域内，包含数号染色体的一个印记区域内，包含数个蛋白编码基因和一个非常保守的个蛋白编码基因和一个非常保守的microRNA聚集区聚集区。 第一次明确提出了鉴定多能性细胞的有效标志，此项成果第一次明确提出了鉴定多能性细胞的有效标志，此项成果将革命性地改变干细胞和将革命性地改变干细胞和iPS细胞技术，细胞技术，解决了由于不能解决了由于不能进行嵌合体实验而无法确定人类胚胎干细胞及进行嵌合体实验而无法确定人类胚胎干细胞及iPS细胞多细胞多能性的问题，改变国际干细胞研究格局，大大加速干细胞能性的问题，改变国际干细胞研究格局，大大加速干细胞研究的进程，提高中国在国际干细

15、胞研究领域的战略地位。研究的进程，提高中国在国际干细胞研究领域的战略地位。212223 这些多能干细胞再继续发这些多能干细胞再继续发展、分裂，就形成展、分裂，就形成血液干血液干细胞细胞以及以及皮肤干细胞皮肤干细胞等等，等等，而这些干细胞再进一步而这些干细胞再进一步分分化成各式各样的体细胞、化成各式各样的体细胞、组织以及器官组织以及器官。从这个角。从这个角度来看的话，如果我们能度来看的话，如果我们能得到全能细胞或是多功能得到全能细胞或是多功能干细胞，然后做进一步的干细胞，然后做进一步的研究，就有可能发现如何研究，就有可能发现如何从从一个细胞发展成一个器一个细胞发展成一个器官官。 单能干细胞单能干

16、细胞24干细胞的分类干细胞的分类 按分化潜能分按分化潜能分:全能全能干细胞干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞, iPS）单能干细胞单能干细胞25全能干细胞全能干细胞 可可有序分化有序分化成来自内、中、外三个胚层的各种细胞成来自内、中、外三个胚层的各种细胞26干细胞的分类干细胞的分类 按分化潜能分按分化潜能分:全能全能干细胞干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞多能干细胞（诱导多能干细胞, iPS）单能干细胞单能干细胞 按供体组织所处发育时期按供体组织所处发育时期胚胎期干细胞胚胎期干细胞成体干细胞成体干细胞27成体干细胞成体干细胞（adult stem cell，ASC） 1.

17、1.成体干细胞可成体干细胞可分化分化成某一组织或器官的所有类型成某一组织或器官的所有类型的终末分化细胞的终末分化细胞. .2.2.成体干细胞成体干细胞来源来源: : 骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨髓、血液、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和脂肪骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、胃肠道上皮、胰腺和脂肪3.3.可塑性（可塑性（plasticityplasticity）：）：一种成体干细胞生成另一种一种成体干细胞生成另一种组织细胞的能力。例如骨髓源性的成体干细胞分化为类似神组织细胞的能力。例如骨髓源性的成体干细胞分化为类似神经细胞的细胞。经细胞的细胞。28干细胞的特点干细胞的特

18、点 多向分化多向分化 自我更新自我更新 可塑性可塑性成成体体干干细细胞胞的的可可塑塑性性29根据其来源组织分：根据其来源组织分：血液干细胞（来源于血液）血液干细胞（来源于血液） 胰腺干细胞（来源于胰腺组织）胰腺干细胞（来源于胰腺组织） 神经干细胞（来源于神经组织）神经干细胞（来源于神经组织） 多属于成体干细胞多属于成体干细胞 如如: :30生命科学生命科学新药试验新药试验疾病研究疾病研究31第三节第三节 间充质干细胞间充质干细胞32（一）分离培养特性（一）分离培养特性（二）表型特征（二）表型特征 （三）自我更新及可塑性（三）自我更新及可塑性 一一MSC的生物学特性的生物学特性33（一）分离培养

19、特性（一）分离培养特性2020世纪世纪7070年代年代, Fredenstein , Fredenstein 等等首先成功地从骨髓中分离出首先成功地从骨髓中分离出MSCMSC全骨髓标本全骨髓标本 分离方法分离方法：培养培养 约约2 2h h后后 未黏附细胞：造血干细胞、未黏附细胞：造血干细胞、 造血后代细胞造血后代细胞黏附细胞黏附细胞：即为即为MSCMSC呈纺锤形呈纺锤形 间充质干细胞间充质干细胞（mesenchymal stem cellmesenchymal stem cell，MSCMSC）是中胚层发育的早是中胚层发育的早期细胞期细胞脂肪、皮肤脂肪、皮肤34（二）鉴定（二）鉴定形态形态表

20、型表型中胚层分化中胚层分化35二二 分化潜能分化潜能（一）（一）MSCMSC的成骨分化的成骨分化（二）（二）MSCMSC的软骨分化的软骨分化（三）（三）MSCMSC的成脂分化的成脂分化 （四）（四）MSCMSC的成肌分化（用的成肌分化（用5-5-氮胞苷诱导）氮胞苷诱导）（五）（五）MSCMSC的成肝分化的成肝分化 （六）（六）MSCMSC的神经分化的神经分化36（一）（一）MSC的成骨分化的成骨分化1994 年，年，Richard等：等：10 -8M地塞米松地塞米松重组重组BMP-2成骨细胞成骨细胞MSC1997年年Jaiswal 等优化了成骨诱导体系，等优化了成骨诱导体系， 发现在发现在DM

21、EM中加入中加入 100mM地塞米松地塞米松 0.05 mM抗坏血酸抗坏血酸-2- 磷酸盐磷酸盐 10mM-磷酸甘油磷酸甘油 效果最好效果最好37（二）（二）MSC的软骨分化的软骨分化 体外诱导：体外诱导： 体内实验：体内实验： 自体自体MSC 促进半月板等软骨中的缺陷修复促进半月板等软骨中的缺陷修复38（三）（三）MSC的成脂分化的成脂分化 地塞米松地塞米松体外诱导体外诱导 MSC成脂肪细胞；成脂肪细胞；1,25(OH)2 D 3抑制地塞米松对抑制地塞米松对MSC的该分化作用的该分化作用临床上大剂量激素治疗后临床上大剂量激素治疗后， 股骨骨髓内脂肪组织增多，股骨骨髓内脂肪组织增多， 骨内压增

22、高，骨内压增高， 骨循环障碍骨循环障碍 同时骨修复过程缓慢同时骨修复过程缓慢 可能是大剂量激素治疗后可能是大剂量激素治疗后股骨头缺血性坏死股骨头缺血性坏死的原因的原因39 （四）（四）MSC的成肌分化的成肌分化(用用5-氮胞苷诱导氮胞苷诱导) （五）（五）MSC的成肝分化的成肝分化 雌性受者雌性受者鼠肝受损，鼠肝受损，接受接受雄性供者雄性供者鼠的鼠的MSC移植，移植，移植后第移植后第13 天，天， 在受者鼠中间在受者鼠中间检测到供者来源的肝细胞和肝卵圆细胞检测到供者来源的肝细胞和肝卵圆细胞40（六）六）MSC的神经分化的神经分化体内实验：体内实验：1999年，年，Azizi 等等直接将人骨髓基

23、质细胞注射入鼠纹状体白质中，直接将人骨髓基质细胞注射入鼠纹状体白质中， 发现发现MSC在局部微环境的诱导下分化为在局部微环境的诱导下分化为星形细胞星形细胞 少突胶质细胞少突胶质细胞 神经元神经元41Brazelton从转基因鼠（表达绿色荧光蛋白，从转基因鼠（表达绿色荧光蛋白，GFP ）中获得成年骨髓细胞，中获得成年骨髓细胞，通过尾静脉注射入通过尾静脉注射入受到致死剂量照射的同基因小鼠中，受到致死剂量照射的同基因小鼠中， 发现各类脑细胞中都含有发现各类脑细胞中都含有GFP 阳性的细胞，阳性的细胞， 且多数且多数GFP 阳性的细胞显示出神经特异性标志阳性的细胞显示出神经特异性标志体外实验体外实验：

24、2000年年Woodbury等首次：等首次：人和大鼠人和大鼠 MSC 2-巯基乙醇和巯基乙醇和BHA体外诱导体外诱导 神经细胞神经细胞42（一）研究细胞增殖与分化机理的模型（一）研究细胞增殖与分化机理的模型MSC的应用的应用 利用利用MSCMSC在体外可以分化为成骨细胞、软骨细在体外可以分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞和脂肪细胞等模型胞、肌肉细胞和脂肪细胞等模型, ,可以可以研究在分化研究在分化过程中信号转导系统、基因表达的差异过程中信号转导系统、基因表达的差异等，为进一等，为进一步阐明其中的分化机理奠定基础步阐明其中的分化机理奠定基础. .4344（二）组织工程的种子细胞（二）组织工程的种

25、子细胞组织工程是在体外构建组织工程是在体外构建有生物活性的组织用于损伤组织或器官的修复。有生物活性的组织用于损伤组织或器官的修复。寻找满意的种子细胞是组织工程的关键环节寻找满意的种子细胞是组织工程的关键环节MSC MSC 分离方便分离方便 扩增迅速扩增迅速 具多向分化潜能具多向分化潜能 适合自体移植适合自体移植 因此是一种合适的种子细胞因此是一种合适的种子细胞种子细胞种子细胞+ +生物可降解材料生物可降解材料4546（三）（三）MSC细胞替代治疗细胞替代治疗 1 MSC具有支持造血的功能，具有支持造血的功能， 2 可用可用MSC治疗心肌损伤或坏死治疗心肌损伤或坏死 3 可用可用MSC治疗神经退

26、行性疾病治疗神经退行性疾病 4 可用可用MSC治疗软骨损伤治疗软骨损伤 因此将体外扩增的因此将体外扩增的MSC与造血干细胞与造血干细胞 联合输注联合输注 可提高造血干细胞移植的成功率可提高造血干细胞移植的成功率4748（四）基因治疗（四）基因治疗 例如例如骨形成缺陷骨形成缺陷是一种是一种I 型胶原基因变异病型胶原基因变异病 改造过的改造过的MSC分化的成骨细胞形成正常的类骨质分化的成骨细胞形成正常的类骨质用基因转染的用基因转染的MSC治疗遗传缺陷性疾病治疗遗传缺陷性疾病 （MSC易于外源基因的导入）易于外源基因的导入）将携带正常将携带正常I 型胶原基因的载体型胶原基因的载体转入自体的转入自体的

27、MSC扩增扩增回输到病人骨髓中回输到病人骨髓中49成骨缺损成骨缺损 获得性骨疾病获得性骨疾病遗传性骨疾病遗传性骨疾病的基因治疗的基因治疗血友病的基因治疗血友病的基因治疗神经系统疾病神经系统疾病 （如帕金森氏病）（如帕金森氏病）的的 基因治疗基因治疗50第四节第四节 成体干细胞及其应用前景成体干细胞及其应用前景一一 造血干细胞：造血干造血干细胞：造血干/祖细胞移植（重建造血）祖细胞移植（重建造血）二二 神经干细胞神经干细胞 在成年动物脑室下区在成年动物脑室下区 在成年小鼠脊髓内在成年小鼠脊髓内 在成年大鼠海马在成年大鼠海马 神经干细胞的存在部位：神经干细胞的存在部位：上海华山医院朱剑虹教授上海华

28、山医院朱剑虹教授 将从八名脑部受损的将从八名脑部受损的病人体内提取的中间干细胞病人体内提取的中间干细胞重新植入病人脑部重新植入病人脑部 51（一）内皮祖细胞（一）内皮祖细胞骨髓中存在内皮干细胞骨髓中存在内皮干细胞： 骨髓来源的细胞骨髓来源的细胞能够进入大鼠小鼠缺血的心肌区域，能够进入大鼠小鼠缺血的心肌区域，生成血管生成血管和心肌细胞和心肌细胞从外周血中分离到内皮祖细胞从外周血中分离到内皮祖细胞 自体移植入缺血一侧肢体自体移植入缺血一侧肢体 促进新血管的形成促进新血管的形成外周血中存在内皮祖细胞：外周血中存在内皮祖细胞：三三 其他组织的成体干细胞其他组织的成体干细胞 52（二）骨骼肌干细胞（二）

29、骨骼肌干细胞（三）皮肤上皮祖细胞（三）皮肤上皮祖细胞（四）胰腺和肝脏的干细胞（四）胰腺和肝脏的干细胞53脐血干细胞脐血干细胞54第二节第二节 人胚胎干细胞及其应用前景人胚胎干细胞及其应用前景 一人一人ES细胞细胞（一）人（一）人ES细胞研究概况细胞研究概况 （二）人（二）人ES细胞系的特征细胞系的特征（三）人（三）人ES细胞的鉴定方法细胞的鉴定方法55（一）人（一）人ES细胞研究概况细胞研究概况 1989年年 Prea 等从人畸胎瘤分离等从人畸胎瘤分离ES细胞细胞1994年年Bonyno等在胚胎发育至囊胚后等在胚胎发育至囊胚后添加白血病抑制因子添加白血病抑制因子( LIF) ，获得类人，获得类

30、人ES细胞克隆细胞克隆1995年年 Thomson 等从恒河猴的囊胚中等从恒河猴的囊胚中分离建立恒河猴分离建立恒河猴ES细胞系细胞系（第一个建株的灵长类动物的（第一个建株的灵长类动物的ES细胞）细胞）561998 年月李树浓等年月李树浓等从体外受精胚胎分离到人的类从体外受精胚胎分离到人的类ES细胞，细胞，开创了人类开创了人类ES细胞分离克隆的先河细胞分离克隆的先河1998 年年11月月 Thomson 等等从体外受精胚胎发育至囊胚期的个从体外受精胚胎发育至囊胚期的个内细胞团分离克隆出个人内细胞团分离克隆出个人ES细胞系细胞系1998年年 Gearhart等等从受精后周流产胎儿的生殖嵴从受精后周

31、流产胎儿的生殖嵴和肠系膜中分离克隆出个多能干细胞系和肠系膜中分离克隆出个多能干细胞系57（二）人（二）人ES细胞系的特征细胞系的特征形态特征形态特征：胞体体积小，核大，有一个或多个核仁胞体体积小，核大，有一个或多个核仁 生长特性生长特性：ES细胞系集落中，细胞系集落中，ES细胞紧密堆积，细胞紧密堆积，无明显细胞界限，形似鸟巢无明显细胞界限，形似鸟巢 核型核型：具有稳定的整倍体核型：具有稳定的整倍体核型具有正常具有正常XY核型核型 XX核型核型58 细胞冻存、解冻细胞冻存、解冻经适宜的冷冻、解冻后不丧失生长增殖等特性经适宜的冷冻、解冻后不丧失生长增殖等特性 细胞表面抗原细胞表面抗原人人ES细胞表

32、达早期胚胎阶段特异性抗原细胞表达早期胚胎阶段特异性抗原（SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81）和碱性磷酸酶和碱性磷酸酶（注：（注：SSEA：特化时期胚胎抗原，：特化时期胚胎抗原， TRA：肿瘤抵抗抗原）：肿瘤抵抗抗原） 端粒酶活性：人端粒酶活性：人ES细胞高度表达端粒酶活性细胞高度表达端粒酶活性（而人二倍体细胞缺乏端粒酶活性）（而人二倍体细胞缺乏端粒酶活性）597 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AKP)的表达的表达8 人人ES细胞的分化潜能细胞的分化潜能AKP常用来作为鉴定常用来作为鉴定ES细胞分化与否的标志之一细胞分化与否的标志之一ES分化之前：分化之前：AKP（）（

33、）ES已分化的已分化的 ：AKP弱阳性或阴性）弱阳性或阴性）（）（） 体内分化潜能体内分化潜能 （）（） 体外分化潜能体外分化潜能 （3） 嵌合体试验嵌合体试验 60（）（）体内分化潜能体内分化潜能： 人人ES细胞在体内可向三个胚层分化细胞在体内可向三个胚层分化（）（）体外分化潜能体外分化潜能： 体外常用滋养层或白血病抑制因子体外常用滋养层或白血病抑制因子 来来抑制抑制人人ES细胞细胞分化分化，同时保证其增殖。，同时保证其增殖。 当去除这些因素或加入某些分化诱导剂时，当去除这些因素或加入某些分化诱导剂时， ES细胞会进行定向分化。细胞会进行定向分化。 体外培养条件下，体外培养条件下，ES细胞通

34、常可分化为细胞通常可分化为 造血细胞神经细胞心肌细胞造血细胞神经细胞心肌细胞骨骼肌细胞上皮细胞骨骼肌细胞上皮细胞61（3）嵌合体试验：）嵌合体试验： 是传统验证是传统验证ES细胞全能性的重要实验，细胞全能性的重要实验，即即ES细胞与正常胚胎嵌合，细胞与正常胚胎嵌合，如能产生各个组织器官的如能产生各个组织器官的嵌合体嵌合体而且而且能产生功能性配子的嵌合体，能产生功能性配子的嵌合体，即可证实分离到全能性的即可证实分离到全能性的ES细胞系。细胞系。6263（四）人（四）人ES细胞的鉴定方法细胞的鉴定方法 ES细胞形态学鉴定：形态结构和生长特性细胞形态学鉴定：形态结构和生长特性2 核型分析：具有正常二

35、倍体核型核型分析：具有正常二倍体核型3 碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶染色4 SSEA免疫荧光标记免疫荧光标记5 分化能力检测分化能力检测64（1）体外分化试验）体外分化试验 （2）体内分化试验）体内分化试验 （3）嵌合体形成）嵌合体形成5 分化能力检测分化能力检测65（1）体外分化试验）体外分化试验 将所得细胞系制成悬液培养，将所得细胞系制成悬液培养，若为若为ES细胞，则细胞，则部分细胞部分细胞贴壁贴壁，分化为神经肌肉软骨等不同组织细胞，分化为神经肌肉软骨等不同组织细胞，部分细胞部分细胞悬浮悬浮生长生长，形成简单类胚体和囊状胚体形成简单类胚体和囊状胚体66 将获得的一定量的细胞将获得的一定量的细胞 注射到同源动物的皮下，注射到同源动物的皮下， 若该细胞为若该细胞为ES细胞，则经过一段时间后，细胞，则经过一段时间后， 动物皮下注射处有组织瘤生成，动物皮下注射处有组织瘤生成， 取取瘤切片瘤切片可见代表可见代表三个胚层三个胚层的不同组织细胞的不同组织细胞（2）体内分化试验）体内分化试验 67（3）嵌合体形成）嵌合体形成将将ES细胞细胞注射或聚合至受体注射或聚合至受体胚胎胚胎， 再将该