五子衍宗方主要药效学成分

1、五子衍宗方主要药效学成分药代动力学方法研究项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心五子衍宗方为中药经典古方，源自唐代悬解录。其功用主治为补肾益精，用于治疗肾虚腰痛，尿后余沥，以及不孕不育症等。中国药典以成方制剂五子衍宗丸形式收载，其处方组成为：菟丝子400g、枸杞子400g、覆盆子200g、车前子100g和五味子50g。在五子衍宗方中菟丝子和枸杞子为方中的君药。目前中国药典对五子衍宗丸仅有性状和定性鉴不，未有含量测定。菟丝子为旋花科植物菟丝子CuscutachinensisLam.的干燥成熟种子，为常用中药，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等作用，其中黄酮类化合物为要紧成分。目前从

2、菟丝子中提取并鉴定出结构的黄酮类成分有金丝桃甘、棚皮素、紫云英甘、山奈酚等。目前中国药典2000版一部中，未对菟丝子进行含量测定。菟丝子中含有的要紧化学成分以棚皮素及其甘为主，其中金丝桃甘为含量较高的棚皮素甘，因此对菟丝子和五子衍宗方进行含量测定时，以金丝桃甘为指标成分，其理化性质及结构如下：物理性状：淡黄色中霜露NH=），熔点227230c（237239c分解0q|1K1j20D=-831C=0ka解），易溶于甲醇、乙醇、丙酮及毗咤。I金理令结盲galactoseOHO一、五子衍宗方及菟丝子中金丝桃甘的含量测定1实验材料及仪器设备1.1 药品及试剂金丝桃甘对比品：本所植化室提供，纯度达95%

3、以上五子衍宗方药材（菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子）：北京同仁堂药店磷酸（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；乙睛（色谱纯）；Fisher甲醇：（色谱纯）；双蒸水1.2 仪器设备Waters2690高效液相色谱仪及996-二极管阵列检测器，Millennium?2色谱软件，有机相微孔滤膜（0.45pm）针头滤器，BUCHI461电热恒温水浴箱2色谱条件选择菟丝子及五子衍宗方中黄酮类成分较多，其中菟丝子中以棚皮素及其甘为主，五子衍宗方中除菟丝子含有黄酮类成格外，车钞票子中也含有车钞票昔等黄酮类成分。参考文献对菟丝子及五子衍宗中的金丝桃甘测定的色谱条件进行了优选。2.1 检测波长的选择从金丝桃甘的

4、紫外光谱Fig.1可见，其在254nm和355nm均有较大的吸取，文献中多以355nm作为对金丝桃甘的检测波长，要紧考虑其它干扰成分在此吸取较低。因此本论文对菟丝子中含量测定时，第一考虑了355nm作为检测波长，而对五子衍宗方进行含量测定时，其他成分对主峰有干扰，而要紧干扰成分在254nm却有较低的吸取，并与主峰能实现基线分离。因此对五子衍宗方中的金丝桃甘进行含量测定时选用了254nm。图1金丝桃甘甲醇溶液的紫外光谱2.2 流淌相的选择第一以流淌相甲醇一0.5%磷酸（50:50,用三乙胺调pH至3.0）,实验中发觉柱效下降专门快，分析认为使用三乙胺调pH,对色谱柱的损害太大。考虑到常规C18色

5、谱柱的酸性适用范畴，在上述流淌相基础上分不考察了0.5%醋酸、0.05%三氟乙酸以及0.1%磷酸，从保留时刻、分离度和拖尾因子角度进行评判，优选了最佳的流淌相组成。最终确定甲醇：乙睛：0.1%磷酸（40:5:55）作为金丝桃甘流淌相条件。2.3 色谱条件色谱柱：AlltechC18柱（5.m,250mmX4.6mmi.d）流淌相：甲醇-乙睛-0.1%磷酸水溶液（40:5:55）. J 流速：0.8mL/miq,柱温:25C,检现波长:355nm（药能子含量）；254nm（五子彷宗方含量）3实验溶液制备丰11LJ3.1 .对比品溶液的配制（窗称取金丝桃昔标准布10mg置于10mL的容量瓶中，加入

6、甲醇溶解并稀释生配成200刻度；的用。精确吊取上避华桃甘溶液2mL于10ml容量瓶中,h j cmt I1 n n 5%g/m咽的标准溶酒 色谱图见Fig. 2 （355nm）和Fig1 : ir T ”1 i i.3 (254nm)。A-喽朝桃普副南lc氟（355nm獭侬Tm小媪二图3金丝桃昔的HPLC图（254nm检测）3.2 菟丝子供试品溶液制备3.2.1 提取方法考察（1）提取溶剂的选择取菟丝子粉6份（过40目筛）各0.4g,周密称定，置150mL三角瓶中，分不周密加入甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL,称重，加热回流提取2h,冷却至室温，补重，

7、摇匀，以0.45pm滤膜过滤，即得，进样10wL,运算提取药材含量。结果见表Tab.1,实验数据表明以上溶剂中60%乙醇对金丝桃甘的提取率最高。表1对菟丝子提取溶剂的比较表SolventMeOH40%EtOH50%EtOH60%EtOH80%EtOH95%EtOHsample weight(g)0.40070.40060.40130.39910.40170.4002Content(%)0.3420.3500.3520.3650.3530.297(2)提取时刻的比较周密称取菟丝子粉4份各0.4g,加入50mL60%乙醇，称重，加热回流，分不提取0.5、1、2、3、4h,冷却至室温，补重，摇匀，以

8、0.45pm滤膜过滤，即得，进样10wL,运算提取药材含量。结果见表Tab.2,实验数据表明热回流提取2h差不多将菟丝子中的金丝桃甘提取完全。表2对菟丝子提取时刻的比较Time0.5h1h2h3h4hsampleweight(g)0.39930.40120.40060.40090.4006Content(%)0.3150.3130.3220.3180.311(3)溶剂用量比较周密称取菟丝子粉3份各0.4g,分不加入35、50、60mL60%乙醇,称重，加热回流提取2h,冷却至室温，补重，摇匀，以0.45区m滤膜过滤,即得，进样10wL,运算药材含量。结果见表Tab3其中50mL溶剂即能提取完全

9、表3对菟丝子提取溶剂体积的比较Volume35mL50ml60mL3.sample weight(g) riContent(%).3995.4100.40790.4110.40080.352菟丝子供试品溶液制管按照%述条件选择确定确定邕丝子提取方法为： o.Mf- h I r 卜目筛)0.4g,周声中定，置150mL三角瓶电，周密加入60%乙醇50mL,称重，加抽电流提联 即得，进语布匹碰取菟丝子细粉(过冷履匀,以0.45 口. mj|膜过0 I I I I I I IJ I . 一 I 1 I I 1 1 i 1 I ig. 4 七血皿.加篁北即40滤,图4菟丝子60%乙醇提取液的HPLC图

10、(355nm)3.3 五子衍宗方供试品溶液制备3.3.1 五子衍宗方提取方法考察(1)提取溶剂的选择按处方比例周密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、车钞票子0.1g和五味子0.05g,以上药材均为细粉(过40目筛)4份，分不周密加入甲醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL,称重，加热回流提取2h,冷却至室温，补重，摇匀，以0.45m滤膜过滤，各进样10wL,求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.4,表明60%乙醇对五子衍宗方中金丝桃甘的提取率最高。表4五子衍宗方提取溶剂的比较SolventMeOH50%EtOH60%EtOH80%EtOHsamplewei

11、ght(g)1.1631.1661.1621.166content(%)0.1130.1060.1150.113(2)提取时刻按处方比例周密称取五子衍宗方1.15g,加入50mL60%乙醇，称重，加热回流，分不提取1、2、3、4h,冷却至室温，补重，摇匀，以0.45pm滤膜过滤，各进样10pL,求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.5,实验数据表明热回流提取2.0h差不多将五子衍宗方中的金丝桃甘提取完全。表5五子衍宗方提取时刻的比较Time1h2h3h4hsampleweight(g)1.1611.1571.161.162Content(%)0.1170.1190.1180.115(3)溶剂用量

12、比较按处方比例周密称取五子衍宗方1.15g,分不加入35、50、60mL60%乙醇，称重，加热回流提取2h,冷却至室温，补重，摇匀，以0.45wm滤膜过滤，各进样10pL,求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.6。其中50mL溶剂即能将复方中的金丝桃甘提取完全。表6五子衍宗方提取溶剂体积的比较Volume(mL)35mL50ml60mLsampleweight(g)1.1641.1611.159Content(%)0.1120.1140.1143.3.2 五子衍宗方供试品制备按照上述条件选择，确定五子衍宗方中金丝桃甘的提取方法为：按处方比例周密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、

13、车钞票子0.1g和SpectrumIndexPlot五味子 0.05g,；圾 匕药材将两细粉（j事 40目嗣21c，解密加叭 60%不醇 50mL, ：口即 3J4 血 13sg Tl41.40 4时 57?强丁即加；瑁13：/3.24称重，三加热回流提取2h至室温，#卜重摇句，以0,45 ! /I Lm滤jit过滤即得。色橹图觅Fig. 51254nm）对Fig. 7 （355nm）,缺菟区玉盘图见 Fig. 6 (254nm)g口 Fig.智T355ntm）。从色评图能够看到，在/聒5品nm如由于主0%乙醇提取液的HPLC图（2图5 正处干扰组端的色谱峰与金丝桃甘丰峰未能完全分离，在史加扰

14、峰吸取较低，对金丝桃昔主峰商阻碍不大。F魏U缺施丝子的五子屈宗方*60%乙醇提取液的HPLC图（254nm）30031d岫7祐就扭曲0%成能据取液&HPLC图由（355nm）MrUtes表8金丝桃甘的周密度（n=5）4方法学考察4.1 标准曲线的建立/精确量取1mL200wg/mL的金丝桃甘标准溶液，分不置于25mL、20mL、10mL、5mL和2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成一系列的标准品溶液，依“色谱条件”分离，取10pL标准溶液进样。以标准液浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回来，标准曲线见Fig.口302001* (aera kaB.来方程为S有关系数R=0.9

15、999,线08.130203.2叫g/rmLO200250Concentrationrg/mL)表9菟丝子测定周密度4.2 最小检出限以信噪比（S/N）大于3测得金丝桃甘的最小检出限，测定结果见表Tab.7表7金丝桃甘的检测限Hyperoside254nm355nmDetectionlimits(ng)1.361.744.3 周密度试验配制高、中、低浓度的金丝桃甘对比品溶液（浓度分不为203.20Pg/mL,20.32g/mL,8.13g/mL）,进样10pL,连续进样5次，测得峰面积，金丝桃甘不同浓度的相对标准偏差在0.521.96之间。结果见表Tab.8表8金丝桃甘的周密度（n=5）Con

16、centration8.13科g/mL20.32科g/mL203.20科g/mL19876751290251747552070955056335109594Peakarea203905505746514063319999252609551229322067975253165160806X203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525菟丝子中金丝桃甘含量的测定5.1 菟丝子供试品周密度实验取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g,周密称定，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积

17、。结果见表Tab.9,其RSD为0.91%。表9菟丝子测定周密度Peakarea886810891043883854874905872011Averagearea881724.6SD8032.57RSD%0.915.2 重复性实验取同一批菟丝子样品，周密称取0.4g,共5份，各按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项下制备，各进样10wL,求算含量。结果见表Tab.ia其RSD为0.76%表10菟丝子测定重复性Sample12345Sampleweigh(g)0.40120.40660.40220.40800.3991Content(%)0.4130.4190.4110.4150.416Aver

18、agecontent0.415SD0.003165.3 稳固性实验取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g,周密称定，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，分不在2、4、6、8、10、12h连续进样，测得峰面积。结果见表Tab.11,其RSD为1.29%,表明菟丝子供试品在测定时刻12h内保持稳固。表11菟丝子提取液的稳固性Time（h）24681012Peakarea887410895655881845863950871081879336Averagearea879879.5SD11321.63RSD%1.295.4 回收率实验周密称取已测定含量的菟丝子粉9份，各0.4g,随机分

19、成3组，分不周密加入金丝桃甘对比品溶液（1.4mg/mL）1.2、1、0.8ml,按“322菟丝子供试品溶液制备”项下制备，各进样10wL依色谱条件下进行测定。结果见表Tab.12,高、中、低加入量的平均回收率为98.8-100.0%。加入标准品后测得量（H）样品含量（I）回收率（%）=X100%加入标准品量表12菟丝子中金丝桃甘的测定回收率Volume(mL)Sampleweight(g)Amountinsample(mg)Amountadded(mg)Totalamountdetermined(mg)Recovery(%)Average(%)0.40131.681.122.81101.01

20、0.8(n=3)0.40651.701.122.82100.02100.00.40381.691.122.8099.070.40011.671.403.0699.291.0(n=3)0.40101.711.403.13101.0299.60.40211.681.403.0698.590.40901.691.683.3397.611.2(n=3)0.40791.711.683.3798.7798.80.40861.711.683.39100.035.5 菟丝子样品测定采纳外标法，每次实验以随行标准运算含量，运算公式如下:MrAi菟丝子中金丝桃甘的含量（）=x100%MArMr：标准物质的量（g）

21、Ar：标准物质峰面积M:菟丝子样品重量（g）Ai:样品中成分金丝桃甘的峰面积周密称取菟丝子粉6份各0.4g,按“菟丝子供试品溶液制备”项下操作。各进样10wL,按外标法运算含量。菟丝子结果见表Tab.13,菟丝子中金丝桃甘的平均含量为0.419%(g/g),RSD为2.98%。表13菟丝子中金丝桃甘的含量测定结果(n=6)Sample123456Sampleweigh(g)0.40030.40800.40690.40820.40400.4008Content(%)0.4140.4170.4190.4110.4440.411Averagecontent(%)0.419RSD%2.986.五子衍宗

22、方中金丝桃甘含量的测定6.1 五子衍宗方供试品周密度实验按处方比例周密称取五子衍宗方样品1.15g,按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积。结果见表Tab.14,其RSD为0.32%表14五子衍宗方测定周密度Peakarea10289441020762102298610223661021543Averagearea1023320SD3253.93RSD%0.326.2 五子衍宗方供试品重复性实验按处方比例，周密称取五子衍宗方样品1.15g,共5份，按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项下制备，各进样10wL,求算含量。结果见表Tab.15其RS

23、D为1.43%.表15五子衍宗方测定重复性sample12345sampleweigh(g)1.15431.15651.15691.15591.1612Content(%)0.1160.1170.1140.1140.113Averagecontent(%)0.115RSD%1.43按处方比例周密称取五子衍宗方样品1.15g,按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，分不在2、4、6、8、10、12连续进样,测得峰面积。结果见表Tab.16,其RSD为0.55%,表明五子衍宗方供试品中测定时刻12h内保持稳固。表16五子衍宗方测定溶液稳固性Time(h)24681012Peak

24、area102981810128101023534101994910232651024561Average1022323SD5651.03RSD%0.556.4 回收率实验按处方比例周密称取五子衍宗方样品1.15g,共9份，随机分成3组，分不周密加入金丝桃甘对比品溶液（1.414mg/mL）1.2、1.0、0.8ml,按“3.3.2五子衍宗方供试品溶液制备”项下制备，各进样10pL依色谱条件下进行测定。按下列公式运算，结果见表Tab.17,高、中、低加入量的平均回收率为99.2-102.7%。加入标准品后测得量（H）样品含量（I）回收率（%）=X100%加入标准品量表17五子衍宗方中金丝桃甘的

25、测定回收率Volume(mL)Sampleweight(g)Amountinsample(mg)Amountadded(mg)Totalamountdetermined(mg)Recovery(%)Average(%)1.1511.6851.1312.864104.10.8(n=3)1.1531.6801.1312.848102.7102.71.1481.6861.1312.824101.21.1531.6891.4143.09399.31(n=3)1.1551.6821.4143.136103.4101.11.1511.6901.4143.118100.61.1581.6931.6973.4

26、31102.31.2(n=3)1.1541.6781.6973.37299.599.21.1501.6771.6973.30195.76.5五子衍宗方的样品测定同“5.5菟丝子样品测定”项，亦采纳外标法，每次实验以随行标准运算含量，运算公式如下：MrAi复方中金丝桃甘的含量（）=x100%MAr式中：Mr-标准物质的量（g）;Ar-标准物质峰面积；M-五子衍宗方样品重量（g）;Ai-样品中成分金丝桃甘的峰面积按处方比例周密称取6份各1.15g,按“五子衍宗方供试品溶液制备”项下操作。各进样10wL,按外标法运算含量。结果见表Tab.18,在五子衍宗方中金丝桃甘的平均含量为0.116%（g/g）

27、,RSD为1.76。表18五子衍宗方中金丝桃甘含量测定结果Sample123456Sampleweight(g)1.15501.15751.15491.15511.16081.1613Content(%)0.1170.1190.1150.1150.1160.113Averagecontent(%)0.116RSD%1.76二、菟丝子及五子衍宗方大鼠血浆药代动力学研究本研究通过建立RP-HPLC法，以金丝桃甘为指标成分，对五子衍宗方药代动力学进行了可行性研究。测定了五子衍宗方80%乙醇提取物，菟丝子80%乙醇提取物，及纯品金丝桃甘大鼠腹腔给药后，不同时刻的血浆药物浓度。并以中国药理学会数学药理专

28、业委员会编制的3P87软件处理时刻平均血药浓度数据，以拟合优度（goodnessoffit）和AIC判定曲线拟和程度，选择房室模型，运算得到了药代动力学参数。1实验材料及仪器设备1.1 药品及试剂金丝桃甘对比品本所植化室提供，纯度达95%以上五子衍宗方药材（菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子）购自北京同仁堂药店无水乙醇（分析纯）北京化工厂肝素钠常州新华活性材料研究所磷酸（分析纯）丙二醇（分析纯）乙腈（色谱纯） 甲醇（色谱纯） 双蒸水氯化钠注射液1.2 动物北京化工厂北京化工厂Fisher公司产品；江苏淮安塑料制品厂；北京协和药厂；石家庄制药集团。Wistar雄性大鼠200-220g,购自中国

29、药品生物制品检定所动物中心，许可证编号：SCXK11-00-00101.3仪器设备Waters2690高效液相色谱仪及996-PDA型检测器，北京医用离心机厂制造的LD5-2A离心机，江苏医疗器械厂制造的液体快速混合器，微量移液器（20-200mL,德国Fisherbrancd）2色谱条件的选择2.1 检测波长的选择按照金丝桃甘的紫外吸取，对254nm和355nm两波长进行了考察。实验中发觉，在254nm下，血浆中的内源性物质对金丝桃苷有较强的干扰作用。在五子衍宗方中测定金丝桃甘含量时采纳了254nm,目的是排除其他组分的干扰，但在大鼠腹腔注射五子衍宗方乙醇提取物后取得的血浆样品中，由于复方的

30、干扰组分进入血浆中含量较低，对血浆中金丝桃苷主峰未有阻碍，而内源性物质在254nm下确对主峰干扰较大，因此在五子衍宗方药代动力学研究中亦选取355nm作为检测波长。2.2 流淌相的选择参考“第二章菟丝子及五子衍宗方金丝桃苷含量的测定”中优选的流淌相条件，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）为流淌相，对金丝桃苷纯品、菟丝子乙醇提取物和五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔给药后血浆中金丝桃苷的色谱条件进行了考察。实验发觉，大鼠腹腔注射五子口.口口号-oofdeD.Q06-衍宗方堤抠物的血浆条件飞，与、暨口2-金丝桃甘M给药 40min后显现代谢产物，在上述流淌相 臀珍向，因叱任原流淌相甲醇-

31、乙睛-0.1%磷 芭流淌木柒匕例的调艇其磔珊型 -乙睛-0.1%瞬酸水溶股(16:14:70)流淌相下，金丝桃甘与五子衍宗方中的代谢产物成分实现基线分离。色谱图见Fig.10和Fig.11:1 n -图10Wistar*制腹腔注射菟丝子80%工醺提取物40分后血浆的HPLj.aoa-tR=10.86mjn金然桃面(5W岐出；甩醇-Z解4口-0；1%磷H 和40：1总 55)图11Wistar大鼠腹腔注射五子衍宗方80%乙醇提取物40分后血浆的HPLC图tR=15.31min金丝桃甘(流淌相:甲醇睛-0.1%磷酸=16:14:70)2.3 内标的选择按照内标选择的原则，选择理化性质与金丝桃甘相近

32、的化合物。对野黄苓甘、芦丁等20多种物质进行了测试，未找到符合条件的内标物。曾经泽在生物药物分析中指出，一定要明确不是所有内标法都能提升分析结果的周密度，在某些情形下，如样品沉淀蛋白后直截了当进样、柱切换进样，外标法反而比内标法好且省事，即使样品经萃取处理，如内标选择不合适，同样外标法会比内标法好。由于未找到合适的内标，样品处理又采纳甲醇沉淀蛋白后直截了当进样，在这种情形下本论文采纳外标法进行定量运算。2.4 色谱条件按照“2.1检测波长的选择”和“2.2流淌相的选择”项下选择的波长和流淌相，对金丝桃甘纯品、菟丝子提取物和五子衍宗方提取物大鼠腹腔给药后的血浆样品分不采取的色谱条件如下：色谱柱：

33、AlltechC18柱(5.m,250mmX4.6mmi.d)流淌相I:甲醇-乙睛-0.1%磷酸水7液(40:5:55)适用于金丝桃昔和菟丝子乙醇提取物大鼠腹腔给药的药代动力学研究。流淌相H:甲醇-乙睛-0.1%磷酸水溶液(16:14:70)适用于五子衍宗方乙醇提取物太鼠腹腔给药词驾鬻徵笔研究。会的六2 830.(5 2938mL/min-IT55ng在遣述色谱条件下，空白血号浆、空白血浆加金丝桃在标t 33DOW酊寸0J腔给药金丝桃甘纯；品及菟整颔取物腹月空给离机无子1558 cSLUD 准商E大鼠腹宗方提取物灌胃给严,Spectiwmlnd&E.图叫三，空白血4 tR=15.44min3

34、14E.19S图HPLCHPLC-DA田牖肃就青-06: 14:co CMo1196610 96015片g登OOC匚图时牛tR=1 行CmI:主自血浆加桃昔的时，甲醇,方乙晴r01%日流0:HPLC-DAD图15Wistar大鼠腹腔注射金丝耳带40分后血浆的HPLC-DAD图40: 5:55)I1Ja-JF1J9JPJp1ZOO4.DD鼠00班圜100D12.D01/加10.000。2D.D022.DC24.00Mrutoa图16Wistar大鼠腹腔注射菟丝子80%乙醇提取物40分后血浆的HPLC-DAD图(流淌相：甲醇-乙睛-0.1%磷酸=40:5:55)3血浆样品预处理方法的选择40.1

35、取条件及提取溶剂选择/采纳蛋白沉淀试剂沉淀血浆蛋白，过滤后直截了当进样和混合溶剂（含蛋白沉淀剂）沉淀蛋白，上清液吹干复溶进样比较。沉淀蛋白过滤后直截了当进样蛋白沉淀试剂选择对金丝桃甘溶解性较好的甲醇、乙醇、丙酮和乙睛。提取方法为：以含有金丝桃甘1.0wg/mL溶液0.1mL为待提取液（加入空白血浆0.2mL）,加入0.5mL溶剂，涡流震荡1min。超声提取10min,3000转/min离心10min（分离有机相中的蛋白），取上清液，微孔滤膜过滤，进样30口。所测得金丝桃甘色谱峰面积，与标准溶液直截了当进样分析所得峰面积值对比，提取率见表19。表19不同蛋白沉淀试剂对金丝桃昔的提取率Deprot

36、einedSolventCH3OHC2H50HCH3COCHCH3CNExtractpercent（%）71653534上清液吹干复溶进样考察了甲醇和乙酸乙酯混合溶剂沉淀蛋白后氮气吹干，残渣复溶进样，比较了甲醇与乙酸乙酯2:1,1:1和1:2不同比例下的提取率。提取方法为：以含有金丝桃甘1.0wg/mL溶液0.1mL为待提取液（加入空白血浆0.2mL）,加入3ml溶剂，涡流震荡1min,3000转/min离心10min,取上清液，氮气吹干溶剂，残渣用500”甲醇复溶，微孔滤膜过滤，进样30口。所测得金丝桃甘色谱峰面积，与标准溶液直截了当进样分析所得峰面积值对比。提取率见表20。表20不同比例甲

37、醇-乙酸乙酯混合溶剂对血浆中金丝桃甘的提取率比较Extractsolvent（MeOHEtOAc）2:11:11:2Extractpercent（%）676054率相对较高，因此以其作为血浆中金丝桃甘的提取方法。40.2 浆样品处理按照“3.1提取条件及提取溶剂”项下，血浆样品的处理方法为：取大鼠血浆0.2mL,置于0.5mLEpphendorf塑料管中，加入甲醇溶液0.3mL,涡流振荡3min,混匀，离心10min（3000转/min）,取上层溶液，用0.45Nm微孔针头滤器过滤，取滤液30wL进行HPLC分析。4方法学考察40.3 准曲线与线性范畴取大鼠空白血浆0.2mL,置于1mLEpp

38、hendof塑料管中，加入金丝桃昔系列标准溶液300pL,分不配制成相当于浓度为0.30,0.60,1.20,1.50,3.00,6.00和15.00Hg/mL的血浆样品，按照“3.2.血浆样品处理”项下操作，建立标准曲线。以血浆中待测物浓度（C）为横坐标，待测物的峰面积为纵坐标，进行回来运算，求得直线回来方程，建立标准曲线。以）40-jZ*为Y=238C 4300.45, R=07,标准曲线见Fig.17,线性范畴在0.e “、 . ./一、 一30-15.005幽/mL。以流淌相H:甲醇-乙睛-0.1%磷酸水7位（16: 14: 70）, k15.运算得鞅的回来方程为 Y=21242.47

39、C-3721.16, R=0.9985,标准曲线见Fi0 C 5g.18。0上述方法在0.30-15.00 g/范畴内线性良好，为减少日间误差，测20 定样鬲时, a 15a 1011015entration（心 g/mL）20流淌相035甲醇-乙睛-0.1%磷酸水溶液夕465:55）,运算得到的回来方程（流淌相：甲醇巧乙睛-04%磷酸=405: 5: 55）2。图15r沙浆中金丝桃昔测定标准曲线0LiS-11Concentrationg/mL）图18血浆中金丝桃昔测定标准曲线（流淌相：甲醇-乙睛-0.1%磷酸=16:14:70）40.4 低检测限以信噪比（S/N）大于3,以两种流淌相条件测得

40、金丝桃甘在血浆中的最低检测浓度均为为0.30wg/mL。40.5 对萃取率实验取金丝桃甘标准溶液0.4、1.0和10.0wg/mL三个浓度各300区L（平行做三个），加入5mL具塞离心管中，各加入200pL空白血浆，其它按“3.2血浆样品处理”项下操作，所测得金丝桃甘的色谱峰面积值，与标准溶液直截了当进样分析所得峰面积值对比，求得各浓度点的平均绝对萃取率。见表Tab.22表22不同浓度的绝对萃取率ConcentrationExtractionpercent(%)MeanRSD(%)0.4g/ml60.862.168.863.96.711g/ml69.373.968.570.64.1210g/m

41、l79.282.276.679.33.5340.6 密度试验配制高、中、低浓度的金丝桃甘对比品溶液（浓度分不为200pg/mL,20pg/mL,8pg/mL）,进样10pL,连续进样5次，测得峰面积，金丝桃昔不同浓度的相对标准偏差在0.521.96之间。结果见表Tab.23.表23HPLC法测定血浆中金丝桃甘的周密度（n=5）Concentration8g/mL20g/mL200科g/mL19876751290251747552070955056335109594Peakarea203905505746514063319999252609551229322067975253165160806X

42、203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525给药提取物的制备与测定5.1 金丝桃甘纯品给药溶液的制备周密称取40.0mg金丝桃甘于20mL容量瓶中，加入20%丙二醇超声助溶，加生理盐水配成2mg/mL的金丝桃甘注射液供大鼠腹腔给药，按照0.5mL/100g给药，相当于按照大鼠体重10mg/kg给药。5.2 菟丝子、五子衍宗方样品处理方式五子衍宗方中五味药材均为种子类药材，其中含有大量的油脂、多糖及各种色素等，第一考察了60，80，95乙醇的提取物，其中60乙醇提取物中含有大量多糖，及部分油脂。提取烘干过程中呈

43、粘稠状，无法做成制剂形式。部分提取物干粉采纳纯品金丝桃苷制剂形式形成混悬物，无法给药。曾尝试采纳大孔树脂进行分离纯化提取物，由于提取物中含有多糖，水溶性粘液质等成分，无法进行洗脱，洗脱柱堵塞。选择以80乙醇提取，减少对多糖及其他水溶性色素的提取。提取前以石油醚脱脂2h，去除大部分的油脂，利于提取物制成干粉。比较了80和95乙醇对金丝桃苷的提取率，以80乙醇提取率较高，因此选择其作为提取溶剂。5.3 菟丝子乙醇提取物大鼠腹腔给药溶液的制备与测定称取80g菟丝子粉，加入800mL石油醍脱脂2h,残渣以2000mL80%乙醇提取3h,过滤，再加入1000mL80%乙醇提取3h。减压回收溶剂，得干粉1

44、1.47g出膏率为14.34%。5.3.1 菟丝子提取物干粉含量测定周密称取0.102g干粉于10mL容量瓶中，加入甲醇，超声提取30min后，定容至10mL。提取液经0.45区m滤膜过滤后，进样10wL,按“第二章菟丝子及五子衍宗方金丝桃苷含量的测定”中优选的流淌相条件，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）为流淌相，按外标法定量。结果菟丝子提取物干粉中金丝桃苷的含量为28.6mg/g。5.3.2 菟丝子提取物给药溶液的制备周密称取3.5g提取物干粉于100mL三角瓶中，加入20%丙二醇超声助溶，加生理盐水配置成40mL相当于2.5mg/mL的金丝桃苷注射液，给药前以0.45m滤

45、膜过滤，按照体重0.5mL/100g给药，折算为菟丝子药材为3g/kg腹腔给药，相当于纯品金丝桃昔12.5mg/kg给药。5.4 五子衍宗方乙醇提取物大鼠腹腔给药溶液的制备与测定按处方比例称取菟丝子粉80g,枸杞子粉80g,覆盆子粉40g,五味子粉10g,车前子粉20g。加入1500mL石油醍脱脂2h,残渣提取两次，各3h,溶剂用量为2500mL和1500mL。减压回收溶剂，得干粉70.8g,出膏率为30.78%。5.4.1 五子衍宗方提取物干粉含量测定周密称取0.104g干粉于10mL容量瓶中，加入甲醇，超声提取30min后，定容至10mL。提取液经0.45m滤膜过滤后，进样10pL,按“第

46、二章菟丝子及五子衍宗方金丝桃甘含量的测定”中优选的流淌相条件，以甲醇-乙睛-0.1%磷酸水溶液(40:5:55)为流淌相，按外标法定量。五子衍宗方干粉中金丝桃甘的含量为2.07mg/g。5.3.2五子衍宗方提取物给药溶液的制备周密称取10g五子衍宗方80%乙醇提取物于100mL三角瓶中，加入20%丙二醇超声助溶，加生理盐水配置成40mL相当于0.52mg/mL的金丝桃甘注射液，给药前亦以0.45m滤膜过滤，按照体重1mL/100g给药，折算为五子衍宗方原药材为8.12g/kg腹腔给药，以菟丝子药材折算为3g/kg腹腔给药，相当于纯品金丝桃甘5.2mg/kg给药。6金丝桃甘纯品、菟丝子提取物、五

47、子衍宗方提取物大鼠体内药代动力学研究6.1 金丝桃甘大鼠腹腔给药实验取雄性Wistar大鼠12只，按体重随机分成2组，给药前置代谢笼禁食Hyperoside pk curve14h,称重、腹腔给药10mg/kg、按照预实验结果、设定11个采血时刻点:2,5,8,12,15,20,30,40,50,75,90(min)。两组动物交替取血,每点分离金丝自眼眶髓脉丛采皿约0.5mL,置肝素化塑管中，3500/min离心10min,血浆,“ 3.2.血浆举取二进行样品处理后，进行 HPLC分析Fig .19：桃甘的居2桐J力学数据及药时曲线分不显Tab.25,P01020304050607080901

48、00Time(min)图19Wistar大鼠腹腔注射金丝桃甘的药时曲线表25Wistar大鼠腹腔注射金丝桃背后金丝桃甘的血药浓度Time(min)Average(科g/mL)SD(科g/mL)1Plasmaconcentration(：gg/mL)5623422.191.053.682.612.642.131.430.6753.230.433.023.863.092.9485.422.206.187.395.965.916.021.07126.123.1511.65.956.465.215.701.82155.211.853.464.075.727.59204.651.475.734.685.

49、175.604.931.76303.370.503.463.194.012.81403.261.344.663.392.663.534.360.95502.290.721.841.623.222.49751.340.511.150.872.21.351.15901.270.601.241.551.490.772.130.44用中国药理学会数学药理专业委员会编制的3P87软件处理时刻-平均血药浓度数据，以拟合优度(goodnessoffit)和AIC判定曲线拟和程度，选择房室模型。金丝桃甘大鼠血浆浓度-时刻曲线符合一室开放模型，以平均值拟合的要紧药动学参数见Tab.26。表26Wistar大鼠腹

50、腔注射金丝桃甘的药代动力学参数ParameterUnitValuesA闵/mL7.17kemin-10.0211kamin-10.204T1/2(Ka)min3.39T1/2(Ke)min32.77T(peak)min12.41C(max)闵/mL4.95AUC304.05CL/F(s)0.0329V/F(c)1.566.2 菟丝子乙醇提取物在大鼠体内药代动力学研究取雄性Wistar大鼠18只，按体重随机分成3组，给药前置代谢笼禁食14h,称重，菟丝子乙酉I提取物腹腔给药（相当于金丝桃甘12.5mg/kg）,按照预实验结果，设定10个采血时刻点：2,5,8,10,12,20,30,50,60,90（min）。三组动物交替取血，每点自眼眶静脉丛采血约0.5mL,置肝素化塑管中，3500转/min离心10min,分离血浆，按“3.2.血浆样品的提取”进行样品处理后，进行HPLC分析。菟丝子提取物中金丝桃甘的药代动力学平均血药浓