分子流行病学 (3)ppt课件

1、分子流行病学分子流行病学Molecular Epidemiology 1 第一节 概述 第二节 主要研讨内容 第三节 研讨实例2分子流行病学产生的背景分子流行病学产生的背景 疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑战疾病防治使流行病学遇到了一些新的挑战 传染病防治传染病防治发现病原体耐药性和变异发现病原体耐药性和变异(流感疫苗流感疫苗)病原生物的多样性病原生物的多样性 (H5N1) 慢性非传染病慢性非传染病复杂性状疾病的病因学问题复杂性状疾病的病因学问题: 基因基因-环境交互作环境交互作用用3分子生物学实际和技术的飞速开展分子生物学实际和技术的飞速开展1953 - Discovery of DNA

2、double helix (Crick & Watson)1960s - DNA transcription mechanism1972 - Recombinant DNA technology1985 - PCR (Kary Mullis)1990s - Human Genome Project2000s - Human Haplotype Project 41990年启动，2019年发表完好的基因序列图5 reference samples: 4 world populationsNigeria30 sets of triosJapan 45 unrelated individua

3、ls China45 unrelated individuals U.S. 30 sets of trios SNPs: computational candidates where both alleles were seen in multiple chromosomes genotypes: high-accuracy assays from various platforms; fast public data release 6分子流行病学的开展历程分子流行病学的开展历程 国外：国外：1972年年-提出提出“流感分子流行病学流感分子流行病学1993年：美国年：美国

4、Schulte出版了世界上第一本分子流行出版了世界上第一本分子流行病学专著病学专著 (Molecular Epidemiology: Principles and Practice)。2019年国际流行病学学术会议：狭义分子流行病学年国际流行病学学术会议：狭义分子流行病学是丈量作为暴露或效应的生物标志是丈量作为暴露或效应的生物标志信息大分信息大分子：子：DNA、RNA和蛋白质。从广义上包括任何实和蛋白质。从广义上包括任何实验的、生化的丈量。验的、生化的丈量。7Numbers of Papers with Subject Words “Molecular Epidemiology on Medl

5、ine2019, more than 2000 on PubMed!8 国内：国内：1985年开场年开场, 将分子生物学研讨中一些技术运用于流将分子生物学研讨中一些技术运用于流行病中疾病诊断以及追踪传染源的调查研讨。行病中疾病诊断以及追踪传染源的调查研讨。1990年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章。一章。从从1992 年第年第4 期起期起,延续延续7 期发期发表文章，引见分子流行病学的产生、定义、研讨表文章，引见分子流行病学的产生、定义、研讨内容、研讨手段及其运用。内容、研讨手段及其运用。9分子流行病学定义分子流行病学定义分子流行病学是运用先进

6、分子流行病学是运用先进的实验技术丈量生物学标的实验技术丈量生物学标志，结合流行病学现场研志，结合流行病学现场研讨方法，从分子程度阐明讨方法，从分子程度阐明疾病的病因及其相关的致疾病的病因及其相关的致病过程，并提出与评价相病过程，并提出与评价相应防制措施的科学。应防制措施的科学。 ( (徐德忠，徐德忠，20192019年年) )分子流行病学是阐明疾病分子流行病学是阐明疾病和安康形状相关生物标志和安康形状相关生物标志或分子事件在人群和或分子事件在人群和生物群体中的分布及其影生物群体中的分布及其影响要素，并研讨防制疾病响要素，并研讨防制疾病、促进安康的战略与措施、促进安康的战略与措施的科学。的科学。

7、 ( (段广才，段广才，20192019年年) )10 分子流行病学是流行病学的一个分支分子流行病学是流行病学的一个分支( (分子生物学？群体遗分子生物学？群体遗传学？传学？) )分子流行病学的主要研讨内容是各种生物标志物及相关过程分子流行病学的主要研讨内容是各种生物标志物及相关过程分子流行病学的研讨方法是随着分子生物学的进展不断更新分子流行病学的研讨方法是随着分子生物学的进展不断更新的的几个要点：几个要点：11 特点：特点： 与传统流行病学不同与传统流行病学不同 与分子生物学不同与分子生物学不同 与群体遗传学不同与群体遗传学不同 宏观与微观相结合的人群研讨！宏观与微观相结合的人群研讨！12传

8、统流行病学传统流行病学暴露暴露疾病疾病 ？ 前瞻性研讨前瞻性研讨回想性研讨回想性研讨分子流行病学分子流行病学传统流行病学与分子流行病学的关系传统流行病学与分子流行病学的关系EDC模型模型Schulte,1993暴露暴露疾病疾病13 研讨内容研讨内容生物标志讨论生物标志讨论 暴露丈量暴露丈量 (E, ID, BED) 效应丈量效应丈量 (EBE, ASF, CD, PS) 易感性丈量易感性丈量 (DNA, RNA, Protein, Phenotype)14生物标志的概念生物标志的概念 生物标志生物标志 (biological markers , biomarkers) 是指能代表生是指能代表生

9、物构造和功能的可识别物质物构造和功能的可识别物质(Phenotype,可丈量可丈量)。 分子生物标志物分子生物标志物 (molecular biomarkers)直接反映外来理直接反映外来理化要素与细胞靶分子化要素与细胞靶分子, 特别是生物大分子如核酸和蛋白质特别是生物大分子如核酸和蛋白质的相互作用及其后果的相互作用及其后果, 是生物标志的主要部分。是生物标志的主要部分。生物标志生物标志15生物标志物的种类生物标志物的种类 暴露标志暴露标志exposure marker, ME与疾病或安康与疾病或安康形状有关的暴露要素的生物标志，称为暴露标志。形状有关的暴露要素的生物标志，称为暴露标志。外暴露

10、标志外暴露标志: 暴露要素进入机体之前的标志和剂量，暴露要素进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、吸烟烟雾等。如病毒、细菌、吸烟烟雾等。内暴露标志：暴露要素进入机体之后的标志。内暴露标志：暴露要素进入机体之后的标志。16 1. 1. 体内剂量标志体内剂量标志IDID：外源性物质于暴露后在体内可：外源性物质于暴露后在体内可丈量到的剂量标志，表示被人体吸收的外源性物质性丈量到的剂量标志，表示被人体吸收的外源性物质性质未改动的或其代谢产物的数量。质未改动的或其代谢产物的数量。吸烟吸烟 - - 血或尿中的烟草代谢产物可的宁浓度血或尿中的烟草代谢产物可的宁浓度多环芳烃多环芳烃 - - 尿中的尿中的1-

11、 1- 羟基芘程度羟基芘程度饮食暴露饮食暴露- - 黄曲霉毒素黄曲霉毒素B1(AFB1)B1(AFB1)和尿中和尿中N-N-亚硝基化合物的亚硝基化合物的浓度浓度任务暴露和环境污染任务暴露和环境污染 - - 血清或脂肪组织中的杀虫剂血清或脂肪组织中的杀虫剂DDTDDT、多氯联苯多氯联苯PCBsPCBs、二氧杂芑环氧化物含量、二氧杂芑环氧化物含量 17 2. 生物有效剂量标志生物有效剂量标志BED：表示已与靶组织细胞内：表示已与靶组织细胞内 DNA或蛋白质相互作用的外源性物质或其反响产物的含量。或蛋白质相互作用的外源性物质或其反响产物的含量。它是反映靶细胞分子内接触剂量的生物标志物它是反映靶细胞分

12、子内接触剂量的生物标志物, 主要包括主要包括蛋白质加合物蛋白质加合物 (Protein adduct) 、DNA 加合物加合物 (DNA adduct) 。18生物有效剂量标志生物有效剂量标志DNA加合物加合物 苯并苯并a a芘芘 白细胞白细胞生物学标志生物学标志环境暴露物质环境暴露物质生物资料生物资料蛋白质加合物蛋白质加合物血红蛋白血红蛋白 环氧乙烯环氧乙烯红细胞红细胞19 效应标志效应标志effect marker, MEF机体暴露后产生功能性机体暴露后产生功能性或构造性的生物标志，称为效应标志。或构造性的生物标志，称为效应标志。生物学反响标志生物学反响标志BR: 反映了由于结合到靶细胞的

13、外源性反映了由于结合到靶细胞的外源性物质的继续作用，进一步引起细胞与组织的生物学或生化物质的继续作用，进一步引起细胞与组织的生物学或生化学的变化。这些变化主要发生在细胞特定部位，尤其在基学的变化。这些变化主要发生在细胞特定部位，尤其在基因的某些特定序列；这些变化可引起机体某些不可逆转的因的某些特定序列；这些变化可引起机体某些不可逆转的生物学效应。生物学效应。疾病标志疾病标志MD 安康形状标志安康形状标志MH20生物学反响标志生物学反响标志生物学标志生物学标志环境暴露物质环境暴露物质生物材料生物材料染色体染色体诱变化学物诱变化学物畸变畸变苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞姊妹染色体单体交换姊妹染

14、色体单体交换苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞微核（微核（micronuci）苯并（苯并（a）芘）芘白细胞白细胞癌基因激活癌基因激活苯并（苯并（a）芘）芘组织组织原嘌呤比例升高原嘌呤比例升高铅铅红细胞红细胞乙酰胆碱脂酶降低乙酰胆碱脂酶降低有机磷杀虫剂有机磷杀虫剂血浆血浆21亚临床早期疾病的生物学标志亚临床早期疾病的生物学标志 血清甲胎蛋白血清甲胎蛋白肝癌、肠道疾病、胎儿神经管缺失肝癌、肠道疾病、胎儿神经管缺失癌胚抗原癌胚抗原胃肠道癌、其它胃肠道疾病胃肠道癌、其它胃肠道疾病肿瘤特异性抗原肿瘤特异性抗原 各种癌症各种癌症生物学标志生物学标志疾病疾病血清谷草转氨酶血清谷草转氨酶心肌堵塞心肌堵塞22

15、易感性标志易感性标志susceptibility markers, MS个体对疾病发个体对疾病发生、开展易感程度的生物标志。生、开展易感程度的生物标志。 易感性主要与宿主的遗传特征易感性主要与宿主的遗传特征,以及生长发育、营养、免以及生长发育、营养、免疫、机体活动形状等有关。不同疾病的不同阶段，都有疫、机体活动形状等有关。不同疾病的不同阶段，都有能够具有不同的易感性标志。能够具有不同的易感性标志。 易感性影响着其它生物学标志在机体内的程度；不同易感性影响着其它生物学标志在机体内的程度；不同个体的易感性不同，与之相关的其它生物学标志的程度个体的易感性不同，与之相关的其它生物学标志的程度也可以不同

16、。也可以不同。23突变剂敏感性分析突变剂敏感性分析24易感性基因标志物：易感性基因标志物：1.1.人类基因组多态性人类基因组多态性(SNPs, CNVs)(SNPs, CNVs)2.2.基因组表遗传修饰基因组表遗传修饰( (甲基化，乙酰化甲基化，乙酰化) )2526 SNP是指在人群中出现的频率是指在人群中出现的频率1%的先天突变。的先天突变。SNP存在于整个人存在于整个人类基因组中，能够每类基因组中，能够每100300bp就存在一个就存在一个SNP，估计总数在数百万个，估计总数在数百万个 人类基因组方案研讨结果阐明，不同个体的基因人类基因组方案研讨结果阐明，不同个体的基因99.9%是一样的，

17、是一样的，但在序列上有极小但在序列上有极小(0.1%)的遗传差别，其中主要是的遗传差别，其中主要是 SNP。 研讨阐明，正是这研讨阐明，正是这0.1%的差别授予他我他特有的表型；这个小小的的差别授予他我他特有的表型；这个小小的差别还与个体对疾病差别还与个体对疾病(包括肿瘤包括肿瘤)的易感性、对药物的反响性差别有亲的易感性、对药物的反响性差别有亲密关系。密关系。单核苷酸多态单核苷酸多态(Single nucleotide polymorphism, SNP)27SNP1 (locus 1)SNP2 (locus 2)GATC 基因型 G/T A/CModified from Yang bioin

18、/seminars/ppt/hap-pool.ppt. 28Haplotype Blocks 单倍型区段单倍型区段人类基因组是由呈现高度人类基因组是由呈现高度连锁不平衡连锁不平衡(LD)的快状区的快状区段陈列构成的段陈列构成的这些区段是由小的低这些区段是由小的低LD的的重组热点区域分隔的重组热点区域分隔的一个单倍型区段可以由一一个单倍型区段可以由一些常见的单倍型的组合来些常见的单倍型的组合来代表代表ChromosomesSNPSHaplotype BlockPatil, Science, 201929分子流行病学的运用分子流行病学的运用1、疾病病因的讨论、疾病病因的讨论 遗

19、传要素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；遗传要素起重要作用的疾病往往与基因有关，这不言而喻；而很多与环境要素有关的疾病，也经常需从基因方面去研讨，而很多与环境要素有关的疾病，也经常需从基因方面去研讨，由于环境要素可以经过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。由于环境要素可以经过宿主的基因突变或异常表达引起疾病。 慢性非传染性疾病慢性非传染性疾病 肝癌肝癌 黄曲霉毒素黄曲霉毒素 体内外检测体内外检测 传染病传染病 AIDS、SARS 分子分型分子分型 302、疾病分布规律以及危险要素致病机理的研讨、疾病分布规律以及危险要素致病机理的研讨 分子流行病学不仅研讨环境与宿主体内的致病因子，分子流

20、行病学不仅研讨环境与宿主体内的致病因子，而且着重研讨这些致病的危险要素，特别是化学物质与生物而且着重研讨这些致病的危险要素，特别是化学物质与生物活性物质从暴露开场至疾病发生全过程的各个环节。活性物质从暴露开场至疾病发生全过程的各个环节。 慢性非传染性疾病鉴定各种恶性肿瘤的危险要素慢性非传染性疾病鉴定各种恶性肿瘤的危险要素, 并并根据个体暴露与遗传等易感要素的相互作用根据个体暴露与遗传等易感要素的相互作用, 确定危险度确定危险度, 挑挑选对特定致癌因子敏感的个体和亚群。选对特定致癌因子敏感的个体和亚群。 传染病如确定风疹病毒传染病如确定风疹病毒RV和巨细胞病毒和巨细胞病毒CMV等在人群中母婴传播

21、的危害程度有多大，诱发畸形或死产、等在人群中母婴传播的危害程度有多大，诱发畸形或死产、流产的危险度如何等。流产的危险度如何等。313 、疾病易感性的测定、疾病易感性的测定 在一样的致病要素作用下，只需一部分人发生某种疾病。这在一样的致病要素作用下，只需一部分人发生某种疾病。这是由于人群对致病因子的反响存在个体差别，只需一部分人对是由于人群对致病因子的反响存在个体差别，只需一部分人对其易感。其易感。 慢性非传染性疾病肿瘤的遗传易感性在暴露到疾病发生的慢性非传染性疾病肿瘤的遗传易感性在暴露到疾病发生的每一步都起作用，包括人群中较常见、低危险度的遗传多态性每一步都起作用，包括人群中较常见、低危险度的

22、遗传多态性和高外显率、人群中稀有的抑癌基因突变。和高外显率、人群中稀有的抑癌基因突变。 传染病测定机体内能否存在某种特异性维护中和抗体传染病测定机体内能否存在某种特异性维护中和抗体的方法了解其对某种传染病能否具有易感性或免疫力的方法了解其对某种传染病能否具有易感性或免疫力 。324、防治效果评价、防治效果评价传染病预防传染病预防 提出的控制措施更有针对性，更有效果提出的控制措施更有针对性，更有效果 基因工程疫苗研制基因工程疫苗研制 非传染病的预防非传染病的预防 分子机理的讨论、易感标志物确实定，为挑选和确定高危分子机理的讨论、易感标志物确实定，为挑选和确定高危险人群提供了科学根据，使慢性病的预

23、防更具有针对性。险人群提供了科学根据，使慢性病的预防更具有针对性。 可以缩短效果评价周期可以缩短效果评价周期!33 研讨方法研讨方法丈量目的的普通原那么丈量目的的普通原那么生物标志应特异、稳定；生物标志应特异、稳定；标本采集、储存方便；标本采集、储存方便；检测方法比较简单、适用，而且操作规范，便于检测方法比较简单、适用，而且操作规范，便于与同类研讨结果比较。与同类研讨结果比较。检测方法灵敏度和特异度高。检测方法灵敏度和特异度高。34常用的实验室检测技术常用的实验室检测技术核酸技术核酸技术DNA & RNA核酸体外扩增核酸体外扩增 PCR核酸电泳图谱核酸电泳图谱 核酸酶切电泳图谱核酸酶切

24、电泳图谱 RFLP核酸分子杂交核酸分子杂交 有原位杂交、有原位杂交、斑点杂交、转印杂交包括斑点杂交、转印杂交包括Southern blot检测检测DNA和和Northern blot检测检测RNA等。等。核酸序列分析核酸序列分析蛋白质技术蛋白质技术 蛋白质分别鉴定技术主要蛋白质分别鉴定技术主要有：电泳、凝胶电泳、蛋白质有：电泳、凝胶电泳、蛋白质转印杂交转印杂交Western blot、色谱分析、蛋白质测序等。色谱分析、蛋白质测序等。酶学技术酶学技术 包括定性和定量检测，要包括定性和定量检测，要求一定的条件。求一定的条件。多位点酶电泳多位点酶电泳multilocus enzyme electro

25、phoresis, MEE法。法。其它技术其它技术 免疫学技术：酶联免疫吸附免疫学技术：酶联免疫吸附实验实验ELISA、荧光免疫实、荧光免疫实验验FIA、放射免疫实验、放射免疫实验RIA、免疫细胞化学检测、免疫细胞化学检测ICC等；等； 色谱技术：高效液相色谱技色谱技术：高效液相色谱技术术HPLC、液相蛋白色谱技、液相蛋白色谱技术术FPLC等。等。35Automated Liquid HandlerSpectroPREPTMNanoliter DispenserSpectroJETTMMALDI-TOF Mass SpectrometerSpectroREADERTMAutomated Ana

26、lysisSpectroTYPERTMMiniaturized BiochipSpectroCHIPTM36Blood Sample Processing and Biomarker Assay Flow Chart37实验室中的质量控制实验室中的质量控制1普通实验质量控制 (1)标本采集和储存 (2)试剂和资料 (3)仪器 (4)实验方法 (5)操作规范2设立多重对照 为保证检测质量，可以设立多种对照，而且可以采取“盲法。 (1)规范对照 (2)空白对照 (3)反复对照3反复实验 (1)实验室内反复实验 (2)实验室间反复实验38研讨实例研讨实例39年龄调整年龄调整肺癌发病率肺癌发病率 20

27、19 (10万万-1)Parkin et al. CA Cancer J Clin. 201940中国烟草消费及销售情况中国烟草消费及销售情况资料来源资料来源: :中国烟草开展报告中国烟草开展报告41Yang et al. JAMA 2019中国人群年龄和性别特异的吸烟率中国人群年龄和性别特异的吸烟率6.9 %60.2 %201935-74Gu et al. Am J Public Health 201910.6 %42性别特异的非吸烟者性别特异的非吸烟者“二手烟二手烟暴露情况暴露情况2000-2019Gu et al. Am J Public Health. 201943肺癌肺癌暴露暴露非肺

28、癌非肺癌遗传易感性遗传易感性 ? ?44Genetic Susceptibility45“Genetics loads gun, but Environments trigger.46Category of SNPsuCoding SNPs (cSNPs): non-synonymous SNPs (nsSNPs)u synonymous SNPs (sSNPs)uNon-coding SNPs (ncSNPs): regulatory SNPs (rSNPs) u Other intronic SNPs (iSNPs)u rSNPs: located at 3UTR/5UTR, promot

29、er region or exon-intron boundaryThe large number of other intronic SNPs! Only genetic marker?47Common genetic variants in miRNAs and flaking regionsHu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2019PNAS 104(9):3300-3305,201948Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 2019Common Pre-miRNA SNPs and miRNA secondary structu

30、re prediction using Mfold 3.2 49Genotype-phenotype correlationHu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 201950Predicted targets of mir-196a2 3p and Report gene assaysMiRNAsGenes Full name or Alternative titlesP value3pLSP Lymphocyte-specific protein 12.73E-03KIFKinesin-like protein KIF2.89E-03PSMD1026S proteasome non-ATPase regulatory subunit 102.92E-03BAG3BAG family molecular chaperone regulator 33.14E-03ALOX15Arachidonate 15-lipoxygenase3.25E-03Hu Z, Chen J, Tian T, et al. JCI 201951Pre-miRNAs SNPs and NSCLC patients survivalGenot