高效液相色谱仪ppt课件

1、Agilent 1100Waters 2487借助气相色谱的理论演变经典的柱色谱高效液相色谱的模块2. 主要部件 (1)高压输液泵高压输液泵单元泵单元泵双双 元元 泵泵 高压泵作用：输送流动相。 也即是贮液瓶中的有机溶剂或缓冲溶液靠高压泵高压泵送入色谱柱。由于色谱柱的阻力很大，高压泵高压泵必须克服阻力以恒定流速输送流动相，这是保证色谱仪精确度的前提。 常用的压力范围：150350105 Pa欧美等国家习惯使用psi作单位 PSI英文全称为Pounds per square inch。 定义为英镑/平方英寸， 它们之间的换算关系为： 1bar14.5psi =105Pa ， 145psi = 1

2、Mpa 1psi = 6.895kPa=0.06895bar 高压泵高压泵应具有以下性能 流量稳定，精度在1%左右 输出压力高，通常2030MPa，最高50 MPa 流量范围宽，一般在0.0110mL/min范围内 能抗溶剂腐蚀 压力波动小、更换溶剂方便、容易清洗、具梯度洗脱 操作方便、容易维修 根据泵的操作原理不同，分为恒压泵和恒流泵 气动放大泵（恒压泵） 往复泵（恒流泵）是目前液相色谱使用最普遍的一种 高 压泵。其中又分单头往复泵和双头往复泵。 往复泵的优点是泵头内腔体积小，容易洗净，故更换 溶剂十分方便，尤其适合做色谱条件试验时使用。 气动放大泵气动放大泵往复柱塞泵往复柱塞泵(2) 进样

3、装置进样装置 手动进样阀通常使用耐高压的六通阀 (美国Rheodyne 公司专利技术)， 其结构如图所示： 进样装置进样装置 （正面）（正面） 进样装置进样装置 （背面）（背面）图中a为进样阀处于“装样load”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样inject”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。自动进样器 色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中，保持色谱柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。

4、（3） 色谱柱色谱柱色谱柱流速方向色谱柱的参数色谱柱（色谱柱（Column） 结构：柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有 筛板，目的是防止填料漏出。 填料：多以硅胶为基质，适用PH 28 粒度多为0.220 m(以510m居多) 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 规格：常规分析柱(常量柱) 内径25mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱长1030cm (15cm，25cm居多） 制备柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制备柱（5mm，7.8mm、9.8mm、10mm） C18柱（C8柱）S iS iOOOS iOOOS iO

5、OOS iOOOS iOOOS iOOOS iOOOS iOOOS iOOOS iOOOS iOOOS iC H2H3CC H3H2CC H2H2CC H2H2CC H2H3CS iC H2H3CC H3H2CC H2H2CC H2H2CC H2H3CC H2H3CC H3H2CC H2H2CC H2H2CC H2H3CS iC H2H3CC H3H2CC H2H2CC H2H2CC H2H3CS iOOOS iC H3H3CC H3S iC H3H3CC H3HHHHHHH主要是由于修饰到硅胶上的硅烷化试剂不同。C8是修饰的带8个碳原子的硅烷，C18是修饰的带18个碳原子的硅烷。C18较C8

6、极性小，C18更适合分析中等到小极性的化合物，C8更适合中等偏大极性 化合物。 C18柱（C8柱）性能影响因素物理性质物理性质硅胶纯度硅胶纯度色谱柱尺寸色谱柱尺寸颗粒形状颗粒形状粒径粒径表面积表面积孔径孔径键合类型键合类型碳覆盖率碳覆盖率封端封端 化学性质化学性质正相柱正相柱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团，如胺基(NH2)和 氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。反相柱反相柱：固定相通

7、常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的 键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被 冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填 料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。 正相柱和反相柱 预柱和保护柱从泵来的流动相预柱进样口保护柱分析柱检测器预柱是针对流动相来保护色谱柱保护柱是针对样品来保护色谱柱precolumn预柱预柱，guard column保护柱保护柱 安装位置不同：安装位置不同：预柱是泵后进样口前，途经流动相；保护柱是进样口后分析

8、柱前，途经样品和流动相。作用不同作用不同：预柱则只能起到过滤颗粒物作用，防止颗粒物堵塞色谱柱筛板引起柱压升高。保护柱除了可以过滤颗粒物外，因为带1厘米长的填料，强保留物质就先留在保护柱的柱芯填料里面，这样可以避免色谱柱被强保留物质污染。 (4) 液相色谱检测器液相色谱检测器 分类 按检测原理： 光学检测器（如紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射） 热学检测器(如吸附热） 电化学学检测器（如库伦、安培） 电学检测器（电导、介电常数） 按测量性质： 通用型检测器（如示差折光、蒸发光散射检测器） 专属型检测器（如紫外、荧光检测器） 按检测方式： 浓度型检测器 质量型检测器着重介绍四种检测器：紫外检测器（

9、光电二极管阵列检测器）、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器a. 紫外检测器紫外检测器(UVD)：应用最广泛的选择性检测器。 双波长紫外检测器双波长紫外检测器 2487 特点特点：选择性检测器， 灵敏度较高（10-9g）， 噪音低。 线性范围宽， 对流速和温度波动不灵敏， 适用于梯度洗脱。光电二极管检测器（光电二极管检测器（PDA） 缺点缺点：只能检测有紫外吸收的物质。 而且对流动相也有一定的限制， 即流动相的截止波长应小于检测波长。在使用紫外检测器时，检测波长与所用溶剂的截止波长接近（或低于截止波长）时，容易产生噪音干扰，从而影响检测结果。所以在使用紫外检测器时，检测波长应至少比所用

10、溶剂的截止波长大20nm以上。 截止波长原理原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来 测量试样浓度的检测器。特点特点：通用性检测器； 对温度变化比较敏感，要保持在0.001 （需配柱温箱使用） ； 灵敏度低(10-6g)； 不能用于梯度洗脱。b. 示差折光示差折光检测器 (RID)原理原理: 利用某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光) 的性质进行检测。许多药物和生命活性物质(多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等)具有天然荧光，能直接检测。c. 荧光检测器荧光检测器 (FLD) 特点特点: 选择性检测器， 灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级， 可达

11、到 10-12g； 选择性好，对流量和温度敏感性低。 缺点缺点：只适合于能产生荧光的物质的检测。 通过通过荧光衍生化荧光衍生化可以使本来没有荧光的化合物转变可以使本来没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围。成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围。d. 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 (evaporative light-scatting detector, ELSD) 在选择溶剂时，在选择溶剂时，溶剂的极性溶剂的极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂， 使保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 流动相对样品具有一定的溶解能力， 保证样品组分不会沉淀在柱中 ( 或长时间保留在柱中 ) 。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 ( 特殊情况除外，如配位色谱等 ) 流动相的黏度要尽量小，以便降低柱压，延长色谱柱 使用的寿命 避免流动相