高效液相色谱法测定心达康片的含量

1、高效液相色谱法测定心达康片的含量    【摘要】  目的应用反相高效液相色谱法测定心达康的含量。方法以甲醇-0.2磷酸（4555）（pH2.27）为流动相，采用C18化学键合硅胶为固定相，在检测波长368nm下进行测定。结果槲皮素、山奈素、异鼠李素三种黄酮分别在7.88g.ml-139.39g?ml-1、1.64g?ml-18.18g?ml-1、23.40g?ml-1117.0g?ml-1范围内线性良好，日内RSD1.38（n3），日间RSD1.96（n3），回收率99.4100.5（n3）。结论该方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。

2、 【关键词】  心达康片；总黄酮；高效液相色谱；含量测定    Abstract:Objective To determination the content of total flavanoids in Xindakang tabalets by RP-HPLC.Methods The contents of quercetin,kaempferol and isofhamnetin were determined by HPLC simultaneously.C18 column（250×4.6mm,5m）was used with the

3、 mixture of CH3OH-0.2% phosphate (4555)（pH2.27）as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL?min-1 with the detection wavelength at 368 nm.Results The calibration curves showed their good linearities in the range of 7.88 g?ml-139.39g?ml-1、1.64g?ml-18.18g?ml-1、23.40g?ml-1117.0g?ml-1 respectively,the w

4、ithin-day RSD and between-day RSD were less than 1.38（n3）and 1.96（n3）respectively;the recovery of total flavanoids was 99.4100.5（n3）.Conclusion The method appeared to be simple,reliable and accurate,and it can be used for the quality control of Xindakang tablets.    Key words:Xindakan

5、g tablets；total flavanoids；RP-HPLC；determination    心达康片主要成分为沙棘总黄酮，具有补益心气、化瘀通脉的功效,对缺血性心脏病、心肌缺血、心血瘀阻型冠心病等疗效显著1。原标准采用比色法2,只能测定其中总黄酮的含量。吕元琦等3采用毛细管电泳法测定出了沙棘药物制品心达康片中山奈酚和槲皮素两种成分，而本实验采用HPLC法同时测定心达康片中槲皮素、山奈素、异鼠李素三个组分,效果好,准确可靠。    1仪器和试药    LC-6A液相色谱仪（岛津）；SPD-10A

6、紫外检测器（岛津）;LC-2002色谱工作站；Branson-200超声清洗仪；GL-88B漩涡混合器（海门麒麟医用仪器厂）；日本A&D电子分析天平。    心达康对照品：槲皮素、山奈素和异鼠李素（中国药品生物制品检定所，供含量测定用）；心达康片样品（四川雅达药业股份有限公司提供，批号：050501、050502、050503，总黄酮标示量为5mg/片）。    甲醇（色谱纯）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。    2方法和结果    2.1对照品溶液的制备

7、0;   分别取心达康对照品（槲皮素、山奈素、异属李素）适量，用甲醇配成含槲皮素19.69g?ml-1、山奈素4.90g?ml-1、异属李素70.14g?ml-1的溶液，即得。    2.2供试品溶液的制备    取本品10片精密称定，研细。精密称取适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。    2.3色谱条件    十八烷基硅烷键合硅胶柱：（150×4.6）m

8、m，5m；流动相：甲醇-0.2磷酸（4555），pH:2.27；检测波长为368nm；进样量：10l。理论塔板数按槲皮素、山奈素和异鼠李素峰计算分别大于4 00046。    2.4流动相的选择    试验了甲醇-水、乙腈-0.02 mol?L-1磷酸溶液、甲醇-0.02 mol?L-1磷酸溶液等不同流动相体系下心达康片中各组分的分离情况，结果以后者为佳；改变该体系中甲醇的比例，结果当甲醇-0.02 mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）时，三组分分离最好，色谱峰达到较高的对称性，获得理想的理论踏板数。由此确定本试验色谱分离流

9、动相为甲醇-0.02 mol?L-1磷酸（45：55）（pH2.27）。    2.5检测波长的确定    按2.1、2.2项下配制对照品溶液和供试品溶液，照分光光度法在200400nm波长范围内扫描，绘制紫外吸收光谱图，结果在368nm波长处有最大吸收，故确定368nm为本品测定波长。    2.6阴性空白试验    按照心达康片处方量，称取空白辅料适量至50ml容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤。取滤液作为供试品溶液，按含量测定的色谱条件进行HPLC检查。结果表明

10、，空白辅料不出峰，不会干扰心达康含量的测定色谱图见图1C。    2.7色谱分离结果    在上述色谱条件下，按槲皮素、山奈素和异鼠李素峰计算分别大于4 000条件下，山奈素与异鼠李素峰完全分离，分离度大于1.5。对照品槲皮素、山奈素和异鼠李素的保留时间分别为12.03min,21.13min,24.13min，样品中槲皮素、山奈素和异鼠李素的保留时间分别为12.04min,21.46min,24.53min，见图1A、B。    2.8标准曲线的制备    按本品含量测定项

11、下方法配制系列浓度对照品溶液，分别精密吸取槲皮素、山奈素和异属李素对照品储备溶液各0.4ml、0.8ml、0.9ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml、2.0ml于10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度对照品溶液，均以10l进样，测得峰面积积分值，浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，槲皮素在7.88g?ml-139.39g?ml-1范围内线性良好，回归方程为：A=26 583C+19 092,r=0.999 2；山奈素在1.64g?ml-18.18g?ml-1范围内线性良好, 回归方程为：A=40 454C5 679.2,r=0.999 0；异鼠李

12、素在23.40g?ml-1117.0g?ml-1范围内线性良好，回归方程为：A=29 542C108 332,r=0.999 2。    用标准曲线低溶液不断稀释进样，测得本品槲皮素、山奈素和异鼠李素最低检出浓度分别为CQ=0.787 7g?ml-1，CK=0.652 8g?ml-1，CI=0.504 0g?ml-1即测得本品槲皮素、山奈素和异鼠李素最低检出量分别为7.87ng、6.53ng、5.04ng，最低检测限图见图1D。    2.9进样精密度试验    取本品10片(批号：050501)，研细，

13、分别称取细粉约150mg、200mg和250mg三份，各置于50ml容量瓶中，用甲醇溶解，超声30min，稀释定容至刻度，过滤，取续滤液进样。照上述色谱条件，10l连续进样测定3次。记录相应峰面积，计算进样精密度结果。槲皮素、山奈素和异鼠李素进样精密度分别0.63、0.30和0.56，满足含量测定要求。    2.10重现性试验    照本品含量测定项下方法配制供试品溶液(批号：050501) 低、中、高浓度共3份，在五个不同日期，照本品含量测定项下方法，测定同一批供试品(批号：050501)含量，槲皮素、山奈素和异鼠李素精密度分别为

14、：低浓度1.05；1.96；0.51，总黄酮4.97mg；。中浓度0.40；0.00；0.30，总黄酮4.96mg。高浓度1.18；0.00；0.63，总黄酮4.95mg。说明样品溶液配制好后五天内测定，结果稳定。    2.11重复性试验    照本品含量测定项下方法配制供试品溶液(批号：050501) 低、中、高浓度各3份，同实验条件下精密吸取供试品溶液10l，注入液相色谱仪在368nm波长处分离检测，记录各浓度对应色谱峰面积，按外标法计算各标示量，槲皮素、山奈素和异鼠李素精密度分别为：低浓度0.52；0.00%；0.31%，总黄

15、酮5.00mg。中浓度0.52；0.00%；0.42%，总黄酮4.97mg。高浓度1.02；0.00；1.38，总黄酮4.98mg。    2.12加样回收率试验    取已知标示量含量（99.50%）的本品(批号：050501)10片，研细，精密称取细粉适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为样品溶液。分别取上述样品溶液5.0 ml 9份于9只10 ml离心管中，分为三组，分别加入低（含Q18.10g?ml-1、K3.98g?ml-1、I62.90g?ml-1

16、）、中（含Q22.60g?ml-1、K4.91g?ml-1、I79.60g?ml-1）、高（含Q26.90g?ml-1、K5.84g?ml-1、I94.70g?ml-1）浓度对照液5ml各三份，混匀，即为回收率考察低、中、高浓度供试品溶液。照本品含量测定的高效液相色谱条件，在368nm波长处分离检测，记录各浓度对应色谱峰面积，计算各组溶液总黄酮的含量，进而计算出回收量，按公式计算回收率。结果见表1。表1回收率测定结果    2.13样品的测定    2.13.1对照品溶液的制备分别取心达康对照品（槲皮素、山奈素、异属李素）适量，用甲醇

17、配成含槲皮素19.69g?ml-1、山奈素4.90g?ml-1、异属李素70.14g?ml-1的溶液，即得。    2.13.2供试品溶液的制备取本品10片，研细，精密称取细粉适量（约相当于心达康5mg），置50ml量瓶中，加甲醇溶解，超声30min，并稀释、定容至刻度，滤过，取续滤液作为供试品溶液。    2.13.3测定方法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10l，分别注入液相色谱仪，以外标法计算，即得。结果见表2。 表2心达康片含量测定结果本次试验了甲醇-水、乙腈0.02mol?L-1磷酸溶液、甲醇0.02mol?L-1磷酸溶液等

18、不同流动相体系下心达康片中各组分的分离情况，结果流动相甲醇0.02mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）时能有效分离心达康片剂中三组分，同时具有条件简单、平衡时间短等特点。加0.2的磷酸使溶液pH为2.27可减少色谱峰的拖尾，使色谱峰达到较高的对称性，获得理想的理论塔板数。由此确定本试验色谱分离流动相为甲醇0.02mol?L-1磷酸（4555）（pH2.27）。    现有的心达康片的部颁标准是以异鼠李素为对照品，1三氯化铝的无水乙醇为显色剂，采用分光光度法测定沙棘总黄酮含量。文中采用RPHPLC法测定心达康片中槲皮素、山奈素、异鼠李素等黄酮含量，不仅可准确测定片中沙棘总黄酮的含量，且可有效地控制各黄酮苷元的含量比例，为完善和提高心达康片的质量控制标准提供依据。【参考文献】  1郑