第二章基因工程基本技术原理-DNA序列

1、第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程第五节第五节 DNA核酸序列分析核酸序列分析返回第二章返回第二章第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程目的与要求目的与要求掌握掌握DNA测序的一般原理和方法，通过学测序的一般原理和方法，通过学习，分析习，分析DNA策序与蛋白质策序的区别。策序与蛋白质策序的区别。重点：重点： Sanger双脱氧链终止法策序原理和方法双脱氧

2、链终止法策序原理和方法难点：难点：如何根据凝胶电泳直接读出如何根据凝胶电泳直接读出DNA序列序列学时：学时：2学时学时学习方法：学习方法：课堂讲授与讨论相结合课堂讲授与讨论相结合第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.1 Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法 2.5.2 MaxamGilbert化学修饰法化学修饰法 2.5.3 序列分析自动化序列分析自动化2.5.4 杂交测序杂交测序2.5.5 DNA策序的商业运作及存在问题策序的商业运作及存在问题2.5.6 思考问

3、题思考问题第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.1 Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法60年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和年代末就已掌握了充分的理论知识，只是当时在某些技术能力上和研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实研究思路上，存在着弱点，阻碍了从理论转变为现实第一，第一，如何分离寡核苷酸片段如何分离寡核苷酸片段；另一方面，在另一方面，在研究思路研究思路上都上都没有摆脱蛋白质序列分析的束缚没有摆脱蛋白质序列分析的束缚。返回返回

4、DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程引物引物延伸测序策略延伸测序策略1968年华裔生物化学年华裔生物化学、生物学家吴瑞博士（生物学家吴瑞博士（DrRay Wu） 独创性地设计出一种崭新的独创性地设计出一种崭新的引物延伸测序策略引物延伸测序策略，并于，并于1971年首次成功地测定了年首次成功地测定了噬菌体两个噬菌体两个COS末端的完整序列；末端的完整序列；1977，F.Sanger在该策略的基础上，发展出了快速测定在该策略的基础上，发展出

5、了快速测定DNA序列的末端中止法；序列的末端中止法；K. Mullis采纳他的方法，完善了采纳他的方法，完善了PCR扩增扩增DNA的方法；的方法；MSmith发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都发明了碱基定点突变技术。这三位科学家全都获得了诺贝尔奖。获得了诺贝尔奖。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.1 .1 Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法原理利用利用DNA聚合酶的两种酶聚合酶的两种酶催反应特性：催反应特性：1、利用单链、利用单链DNA模板，合成模

6、板，合成DNA互补互补链；链；2、利用、利用2，3双脱双脱氧核苷三磷酸作底物，参氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从入到寡核酸链的末端，从而终止而终止DNA链的生长。链的生长。也也称引物合成法称引物合成法，或，或酶催酶催引物合成法引物合成法。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程q反应：反应：同时加入同时加入引物和引物和模板、模板、DNA聚合酶聚合酶1、一、一种种ddNTP、以及以及 四种四种dNTP（有一种带放射性有一种带放射性标记）。标记）。q变性胶电泳分离反应混

7、变性胶电泳分离反应混合物。合物。q放射自显影术放射自显影术，检测单，检测单链链DNA片段的放射性带。片段的放射性带。q结果判读结果判读，从放射性，从放射性X光 底 片 上 ， 直 接 读 出光 底 片 上 ， 直 接 读 出DNA的核酸顺序。的核酸顺序。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程GTACGTTGACGCCddATP ddTTPddGTP ddCTPddCTP ddATP ddGTP ddTTPAGTCAGGATCACC考考你考考你第二章第二章 基因工程基本技术原理

8、基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程酶、原料比例酶、原料比例dNTPddNTP=100：1时时，谱带分离效果较佳，可读出多，谱带分离效果较佳，可读出多于于 200个以上的核苷酸顺序。个以上的核苷酸顺序。降低降低dNTP对对ddNTP浓度比浓度比，会产生逐渐加长的片段，再配，会产生逐渐加长的片段，再配合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到合使用长胶和低浓度的聚丙烯酰氨凝胶，分辨能力可提高到能判读出能判读出300个左右的核苷酸顺序。个左右的核苷酸顺序。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本

9、技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.1.2 Sanger双脱氧双脱氧-M13体系体系 DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及缺陷序列测定法的特点及缺陷分析分析：这样处理后，能：这样处理后，能策得高分子量策得高分子量DNA吗？吗？为了将这些降解的为了将这些降解的DNA片段，按其原来的顺序片段，按其原来的顺序“拼排拼排”起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对起来，至少还需要用一种或数种其它内切限制酶，对同种同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化，并进行电泳纯化

10、和序列分析。高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。片段，供进一步分析。费时、费力、费钱、费时、费力、费钱、DNA损伤严重损伤严重第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程克服缺点的一种途径克服缺点的一种途径DNA分子克隆分子克隆将不同限制酶消化切割的将不同限制酶消化切割的D

11、NA限制片段，随机地克隆到载限制片段，随机地克隆到载体分子上。选用天然的单链体分子上。选用天然的单链 DNA噬菌体，例如噬菌体，例如 M13作为作为载体，重组体噬菌体的载体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引物引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体合成的特定的寡核苷酸，或者是从亲本单链噬菌体DNA中分离出来的一种限制片段。其中分离出来的一种限制片段。其特点是能够特异性地同载体分特点是能够特异性地同载体分子上与克隆位点相连的单链子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交区段杂交。称做。称做“通用引物通用引物” 。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基

12、本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程M13载体克隆载体克隆DNA片段片段将将DNA片段克隆在片段克隆在M13mp载体特定载体特定LacZ区段中区段中重组体噬菌体在含有重组体噬菌体在含有IPTG和和Xgal的培养基平板上形成的培养基平板上形成白白色色的噬菌斑的噬菌斑;非重组体的噬菌体则形成非重组体的噬菌体则形成蓝色蓝色的噬菌斑。的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。第二

13、章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程这种随机的方法，也需要通这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构拼连起来，恢复成原来结构形式的总形式的总DNA序列。序列。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程使用使用M13载体系列的优点载体系列的优点所有的待测定的所有的待测定的DNA片段，都可以共用一种引物。这样，片

14、段，都可以共用一种引物。这样，就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。就避免了合成和分离各种不同引物的许多麻烦。应用应用M13mp载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种载体系列的双脱氧链终止法，已经成为一种最普遍采用的快速最普遍采用的快速的的DNA序列分析法。序列分析法。 第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.1.3 Sanger 双脱氧双脱氧pUC体系体系 DNA序列分析法序列分析法将待测将待测DNA片段克隆到片段克隆到质粒质粒载体上，直接用载体上，直接用闭合环形

15、闭合环形的双链质粒的双链质粒DNA按双脱氧链终止法作按双脱氧链终止法作DNA序列分析。序列分析。这种方法特称为这种方法特称为利用双链质粒利用双链质粒DNA模板的双脱氧模板的双脱氧DNA序列分析法序列分析法。由于通常使用的质粒多是由于通常使用的质粒多是pUC载体系列，载体系列，所以又称之为所以又称之为Sanger双脱氧链终止双脱氧链终止-pUC体系体系DNA序列序列分析法。分析法。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程Sanger 双脱氧双脱氧pUC体系体系 DNA序列分析法基

16、本步骤序列分析法基本步骤待测待测DNA与与pBR322或或pUC分子分子重组重组；转化转化：转化反应物涂布在补加：转化反应物涂布在补加有有Xgal-IPTG选择性培养基平板上，选择性培养基平板上，经经37过夜培养；过夜培养；挑选白色菌落，挑选白色菌落，制备质粒制备质粒NA。碱变性处理碱变性处理，与引物一起退火，与引物一起退火，然后按双脱氧法作序列分析。然后按双脱氧法作序列分析。优点优点：无需将：无需将DNA克隆到克隆到M13载载体上，更为简单快速，现已被许体上，更为简单快速，现已被许多研究工作者采用。多研究工作者采用。返回目录返回目录第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DN

17、A-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.2 MaxamGilbert化学修饰法化学修饰法是是1977年由美国哈佛大学的年由美国哈佛大学的AMMaxam和和W Gilbert 发明的，所以又叫做发明的，所以又叫做MaxamGilbert DNA序列分析法序列分析法虽然说对于大分子量的虽然说对于大分子量的DNA片段的序列测定而言，片段的序列测定而言，化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度化学修饰法并不如双脱氧法方便有效，其发展速度也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中也不及后者迅速，但是至今在相当多的研究工作中仍被采用。

18、仍被采用。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.2.1 Maxam Gilbert化学修饰法的原理化学修饰法的原理化学试剂处理化学试剂处理末端标记末端标记DNA片段片段，碱基的特异性切割碱基的特异性切割产生的产生的DNA片段混合物片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品

19、课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程出发材料出发材料：局部消化的：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定的分子群体中纯化出特定的末端末端带有放射性标记的带有放射性标记的DNA片段片段 (双链或单链）双链或单链）关键：关键：4种核苷酸碱基中，有种核苷酸碱基中，有12种发生特异性的化学切割种发生特异性的化学切割仅应，包括仅应，包括碱基的修饰碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去修饰的碱基从其糖环上转移出去以及以及在失去碱基的部位发生在失去碱基的部位发生DNA链的断裂链的断裂三个主要内容。三个主要内容。第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师

20、范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程碱基特异的化学切割反应碱基特异的化学切割反应肼肼（NH2NH2）肼肼能够从能够从 C4或或 C6位置作用于位置作用于T和和C，并用并用 C4-C5-C6环化形成一种新环环化形成一种新环;进进一步作用释放出吡唑琳酮环一步作用释放出吡唑琳酮环，留下的留下的N1C2N3片段则仍连在糖环上。片段则仍连在糖环上。在具有在具有六氢吡啶六氢吡啶的条件下，通过的条件下，通过-消消除反应除反应，2个磷酸分子从糖片段上释个磷酸分子从糖片段上释放出来，从而导致放出来，从而导致DNA链断裂。链断裂。反应体系中加入反应体系中加入lmol/L浓度的盐，浓度

21、的盐，肼肼同同T的反应速率便会逐渐下降，以确的反应速率便会逐渐下降，以确保发生保发生C特异的化学切割反应。根据特异的化学切割反应。根据这一特点区别这一特点区别C和和C+T之间的降解产之间的降解产物。物。 第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程碱基特异的化学切割反应碱基特异的化学切割反应硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（CH3O）2SO2在在硫酸二甲酯硫酸二甲酯的作用下，碱基环的作用下，碱基环中的氮原子发生中的氮原子发生甲基化反应甲基化反应（G N7和和A N3）。）。中性中性PH：甲基

22、化导致配糖键甲基化导致配糖键水解水解，留下失去碱基的糖一磷酸骨架上留下失去碱基的糖一磷酸骨架上的键。这种键十分微弱，易于使的键。这种键十分微弱，易于使糖片段两翼的糖片段两翼的磷酸脱落，造成磷酸脱落，造成DNA断裂断裂;碱性碱性 pH：采用六氢吡啶同采用六氢吡啶同DNA甲甲基化反应，而这种反应对甲基化基化反应，而这种反应对甲基化的的G是特异的。因此，是特异的。因此，DNA链的链的断裂只在断裂只在G发生。发生。 第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.2.2 化学修饰法测序

23、图解化学修饰法测序图解第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程C T+C G+A ATTATCAGGATGGCGACTTCGA G+A T+C C试试看试试看你作对了吗？你作对了吗？第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.2.3 MaxamGilbert化学修饰法优点化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.3 序列分析的自动化序列分析的自动化返回目录返回目录第二章第二章 基因工程基本技术原理基因工程基本技术原理-DNA-DNA序列测定序列测定西北师范大学西北师范大学 精品课程精品课程 武国凡武国凡基因工程基因工程2.5.4 DNA杂交测序杂交测