创新性实验Word版

1、黄曲霉毒素和牛血清蛋白偶联产物的检测陈琳梅摘要：黄曲毒素B1是只有反应原性而无免疫原性的半抗原,不能直接刺激动物抗体, 只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等载体蛋白连接后才能刺激动物分泌抗体, 利用抗体制成胶体金试纸条快速检测黄曲霉毒素。将黄曲霉毒素肟化、与牛血清蛋白偶联反应的混合产物，以及黄曲霉毒素AFB1、牛血清蛋白BSA，分别经凝胶色谱分离后，选择波长检测色谱分离收集液，获洗脱曲线图。通过比较曲线的峰面积，判断黄曲霉毒素与牛血清蛋白交联结果以及它们的偶联率。关键词：黄曲霉毒素 牛血清蛋白 凝胶柱层析 偶联Abstract： AFB1 is a hapten that onl

2、y has reactionogenicity but no immunogenicity.Tt does not stimulate animal antibodies directly.Only it connect with BSA,OVA and other carriers can stimulate animals to secrete antibodies.And make antibodies into colloidal gold test strip to detect AFB1 rapidly.Oximated AFB1 mixing with BSA coupling

3、reaction, AFB1 and BSA pass by Sephadex column respectively and separate them.At last,select suitable wavelength to test separation medium and gain eluting diagram. By comparing the curves of the peak areas to determine whether AFB1 and BSA coupled each other or not and their coupling rate.Key words

4、: AFB1 BSA Sephadex column chromatograph couple前言黄曲霉毒素（Aflatoxins）是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物特曲霉也能产生黄曲霉毒素，但产量较少。产生的黄曲霉毒素主要B1，B2，G1 ，G2 以及另外两种代谢产物M1 ，M2.其中M1 和M2是从牛奶中分离出来的. B1，B2，G1 ，G2, M1 和M2 在分子结构上十分接近。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。特别是黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)除了有较强的急性毒性外，还有很强的慢性毒性，也是一种强致癌

5、物质(CAST of USA，1989) 。黄曲霉毒素B1常会污染植物和动物源性食品，被动物摄入体内后，还可转化成毒性也较大的黄曲霉毒素Ml等衍生物。黄曲霉毒素B1具有致癌、致畸、致突变作用，对人类健康构成巨大的威胁。加强对黄曲霉毒素2 / 19B1的检测，对确保食品安全具有重要意义。世界上几乎所有的国家和地区都规定了食品及饲料中AFB1的最大允许含量并作为强制性标准进行检测和控制。为了防止AFB1超标的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链,加强对黄曲霉毒素B1的检测是必要的。薄膜层析法和液相色谱法是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法。薄层层析法灵敏度不高，特异性不强，易被其它荧光物质干扰

6、，且分析时间较长；高效液楣色谱法虽然灵敏度高，但检测仪器化程度高、设备昂贵，操作技术要求高，前处理净化要求高；免疫学方法由于其特异性强、灵敏度商，前处理简单，操作简便，比较容易推广使用。研制简便、快速、经济可行的黄曲霉毒素B1的检测方法，对于从源头上控制粮食黄曲霉毒素污染十分重要。黄曲毒素B1是只有反应原性而无免疫原性的半抗原,不能直接刺激动物抗体, 只有和牛血清蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)等载体蛋白连接后才能刺激动物产生分泌抗体。故可采用免疫学方法，将黄曲霉毒素与牛血清蛋白偶联产物注射到小鼠体内，刺激小鼠产生抗体，利用抗体制成胶体金试纸条快速检测黄曲霉毒素，本方法就解决了上述的问题。

7、黄曲霉毒素AFB1与牛血清蛋白BSA偶联产物AFB1-BSA的检测，是建立免疫学快速检测农产品中黄曲霉毒素方法的一项重要工作内容。目前多采用紫外扫描的方法，根据吸收峰的变化判断偶联是否成功，但反应体系共存成分会产生干扰，影响检测判定结果的可信度。本实验用凝胶柱层析的方法对黄曲霉毒素与牛血清蛋白的偶联产物AFB1-BSA的检测方法，在识别黄曲霉毒素与牛血清蛋白偶联产物的同时，可给出偶联反应偶联率的具体数值，提高了检测判定结果的可信度，具有重要的实际应用价值。1.材料和方法1.1主要试剂葡聚糖凝胶G100（北京索莱宝科技有限公司），甲醇（分析纯，国际集团化学试剂有限公司），黄曲霉毒素（以色列，FE

8、RMENTEK公司），牛血清蛋白（上海，生工生物工程有限公司），黄曲霉毒素和牛血清蛋白的偶联产物，黄曲霉毒素和牛血清蛋白的偶联产物标准样品（美国，sigma公司），CMO：羧甲氧基羟氨半盐酸盐，（Adamas Reagent co,ltd.），EDC:对乙基-N-N二甲基丙基二亚胺（程度贝斯特试剂有限公司），DMF：N-N二甲基甲酰胺（国药集团化学试剂有限公司），吡啶（国药集团化学试剂有限公司）1.2主要仪器DBS-160F电脑自动部份收集器（上海精科实业有限公司），层析柱（柱高25.5cm,内径1.2cm左右,市售），石英比色皿（市售，宽1cm），恒温摇床（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），

9、分光光度计（UV110 ，SPECTROPHOTOMETER）1.3方法1.3.1层析柱凝胶的选择凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。葡聚糖凝胶G-75、G-100、G-200分离分子量范围分别是3-80kDa、4-150kDa、5-600kDa，牛血清蛋白的分子量是66.430kDa，试验选用葡聚糖凝胶G100作为层析柱凝胶。1.3.2洗脱剂选择牛血清蛋白BSA易溶于水，而黄曲霉毒素不溶于水，可溶于甲醇。故应选择适当的水与甲醇的比例，

10、使洗脱时牛血清蛋白和黄曲霉毒素都能溶于洗脱剂中。分别在A,B,C,D试管中加入水：甲醇分别为9:1,8:2，7:3,6:4，并加入黄曲霉毒素，结果A,B试管中出现浑浊，C,D试管中澄清，故以30%甲醇为洗脱剂。1.3.3装柱1.3.3.1葡聚糖凝胶G100前处理除去影响流速的过细颗粒“水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。1.3.3.2溶胀取葡聚糖凝胶8g于烧杯中，使用前需直接在欲使用的洗脱液中浸泡溶胀。使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，1-2小时即可。 1.3.3.2装柱装填的重要原则

11、之一就是需要形成一个稳定均一的柱床。胶颗粒越均一(粒径分布越窄)，越容易获得稳定均一的柱床。取层析柱，将层析柱固定在支架上，调整层析柱与水平面垂直。装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出。柱内装放适量洗脱液，排除下接头处滤膜下的空气泡，关闭出口，柱内存留四分之一床体积的洗脱液，加入搅拌均匀的凝胶浆液，打开出口，控制流速，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉隆到层析柱底部，不断补充凝胶浆液至胶面上升至层析柱上部，注意凝胶面上应始终保持有洗脱液。继续加入凝胶悬液，至凝胶沉积约15cm高度即可。新装好的柱要检验其均一性，可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000（又称蓝色右旋糖，商品名为Blue dextran

12、-2000）、红色葡聚糖或细胞色素C等配成2mg/ml的溶液过柱，看色带是否均匀下降，或将柱管向光照方向用眼睛观察，看是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。新柱子裝好后，要检查其密闭性，保证密闭良好。用30%甲醇进行平衡6h左右，调整流速12滴/分钟，保证凝胶的紧实，防止胶面大幅度下沉。1.3.4牛血清蛋白、黄曲霉毒素样品的制备1.3.4.1牛血清蛋白溶液的制备 取牛血清蛋白0.45mg溶于200uL的30%甲醇中备用。1.3.4.2黄曲霉毒素溶液的制备取黄曲霉毒素0.318mg溶于200uL的30%甲醇中备用。1.3.4.3 AFB1与BSA偶联产物样品的制备AFB1

13、与BSA偶联路线：AFB1肟的制备根据文献采用两种方法制备AFB1O。方法一是1 mg AFB1与2mg CMO 溶解于400uL吡啶中，25避光振摇搅拌过夜。方法二是1 mg AFB1与2mg CMO 溶解于1.25mL甲醇吡啶双蒸水混合液中(V:V:V=4:1:1)，25避光振摇搅拌过夜。肟化产物真空冷冻干燥，薄层层析检测。AFB1肟与BSA偶联物的制备分子量AFB1 AFB1O EDC BSAOVAM: 312.27 191.7 66.430K 43K/38Km: 1mg 8.6mg 3.5mg1mg AFB1 肟溶于200uLDMF和水(V:V=6:9)的混合液中，加入1mg EDC避

14、光活化4h，再补加1mg EDC。称7mg BSA（BSA加过量，确保AFB1较多的反应），用 0.13mol/L的NaHCO3溶液制成10% BSA 活化溶液，将BSA溶液逐滴加入上述反应液中。并在28度的恒温振荡摇床上震荡反应。偶联后置于透析袋中透析三天，尽可能除去黄曲霉毒素等小分子杂质后进行冷冻干燥。1.3.4上样打开上接头，用移液枪吸去床面上大部分洗脱液，当洗脱液面接近凝胶床面时，关闭层析柱出口端，用移液枪吸BSA样品0.2毫升，沿管壁小心加样于柱床表面，打开层析柱出口端，待样品完全掺入胶内，开始收集流出液，同时小心加适量洗脱液，连接好层析柱上接头。黄曲霉毒素，黄曲霉毒素和牛血清蛋白的

15、偶联产物用同样的方法上样。1.3.5洗脱和收集为了获得分离，使用适当的流速，确保有足够的时间允许分子可以弥散进入或流出主料，控制流速为每管7滴。将层析柱的上端与电脑自动部份收集器相连，为样品能洗脱完全，通过计算，共设160管。2.结果与分析2.1 AFB1肟的制备将肟化后的两组溶液做TLC，TLC法监控肟化效果见图1： AFB1 AFB1O5 4 3 2 1图1：TLC法监控肟化效果方法一为点2、4，方法二为点3、5。点1为纯AF B1溶于甲醇中，点2、3点样量为2g AFB1初始物，点4、5为6g AFB1初始物。从图中可以看出方法一的溶液中的AFB1较少，说明方法一的肟化效果更好。点1为纯

16、AFB1溶于甲醇中，余为肟化产物：点2、3点样量为2g肟化产物，点4、5为6g肟化产物。2.2 AFB1、BSA及其偶联产物紫外扫描AFB1、BSA及其偶联产物紫外扫描结果见图2：BSAAFB1AFB1-BSA图2 AFBI、C·BSA及其偶联产物紫外扫描图AFB1和BSA的特征吸收波长分别为363nm和278nm，故可选择278nm和363nm检测黄曲霉毒素、牛血清蛋白、以及偶联产物。2.3 AFB1、BSA及其偶联产物凝胶层析AFB1、BSA及其偶联产物凝胶层析结果（检测波长AFB1：363nm、BSA：278nm、AFB1-BSA：363nm）见图3：图3 AFB1、BSA及其

17、偶联产物凝胶层析洗脱曲线图3显示：黄曲霉毒素洗脱时间约为50 min，牛血清蛋白洗脱时间约为8 min。由于363nm检测波长牛血清蛋白基本无吸收，故偶联产物363nm检测波长所得洗脱曲线20-40 min所示峰为偶联产物，55 min所示峰为未透析完全留存的黄曲霉毒素，该结果表明偶联成功。3.讨论本文通过黄曲霉毒素、牛血清蛋白、偶联产物凝胶层析洗脱曲线分析，实现偶联产物的识别。由于时间、试验条件等因素的影响，未对偶联率等进行试验和判定。柱料的死体积过大，分光光度计的精密性等因素对实验结果会产生一定的影响。进一步的工作，将通过优化试验条件，严格定量黄曲霉毒素、牛血清蛋白、偶联产物凝胶层析上样量

18、，增加对偶联产物278nm检测波长所得洗脱曲线的分析，比对黄曲霉毒素、牛血清蛋白、偶联产物凝胶层析洗脱曲线中，黄曲霉毒素、牛血清蛋白、偶联产物峰面积的比值，进而实现偶联率的判定。该项工作的完善，可以为偶联工艺条件的优化提供评判依据，并为黄曲霉毒素检测试剂盒产品开发提供重要的基础条件。4.收获通过这次试验我明白了要做出一些结果不是一朝一夕就能完成的，其中会遭受很多的失败，而在每次失败中必须找出失败原因，并且寻找解决方案。第一次装柱的时候感觉很简单，以为只是把葡聚糖凝胶倒到柱子中就可以了，结果出现柱子断层。向老师请教，吸取经验后，倒凝胶的时候在柱口加上漏斗，并且在柱中牵引一条线，在倒凝胶的时候不断

19、拉扯线以驱赶气泡。但是又出现新的问题，装好柱子后，发现平常用的氯化钠洗脱剂不能溶解黄曲霉毒素，这样我们就必须要寻找新的洗脱剂。黄曲霉毒素溶于酒精和牛血清蛋白易溶于水，根据酒精与水的不同比例不断尝试，最终找出适合的洗脱剂30%甲醇的水溶液。于是这次又重新装柱，但是这次胶体无法下沉，一直呈现透明状，并且在之前保存过程中没处理好，出现霉菌。之后，只能重新买葡聚糖凝胶。处理好胶料，装柱后，开始平衡，但是这次又出现新的问题，平衡时，柱子的流速比蠕动泵泵出的液体流速不一致，导致凝胶顶部干掉，柱子只能重装。看似简单的柱子来来回回装了一个多月，但是其中失败的原因只能由我们慢慢摸索，我们也总结了一些经验：在保存

20、胶体的时候要用到叠氮化钠防止霉菌生长；在装柱的过程中凝胶要一次性倒入，不能分次倒，否则柱子中会分层；在装柱时要用线牵拉，驱赶气泡；最好是用常压，尽量不用蠕动泵让液体流出，防止上下流速不一，造成断层；要尽量减少柱子的死体积。总结经验后，设计加工了一套新的柱层析装置，它是常压操作，并且有顶上有一个梨形漏斗，有足够大的体积装凝胶，避免了多次加凝胶。成功装柱，洗脱后，测定样品的吸光度，黄曲霉毒素和牛血清蛋白的吸光度分别是363nm和278nm，属于紫外光区，应用石英比色皿，而我们不知道这个特点，用了玻璃比色皿，导致吸光度一直是负值。这样磕磕碰碰，我们总算是测出了黄曲霉毒素和牛血清蛋白以及它们的偶联产物的洗脱曲线。虽然没有完成预期的计算它们的偶联率，但是我在试验中受益匪浅，每次的失败和寻找方法都让我的能力增长了许多。参考文献：1. 薛金艳 ，李俏俏，凝胶层析分离蛋白质实验方法的优化，哈尔滨医科大学学报，2002.44（6）2. 陶慧林，寿红娟，朱仕毅，3种黄酮类小分子与牛血清白蛋白间相互作用及其构效关系的研究，广西科学院学报，2010