人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究

1、张津利朱锡华 摘要目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素cDNA。方法：将本室克隆的人淋巴毒素cDNA亚克隆于原核表达载体pBV220,温控法诱导重组菌，SDS-PAGE和Western-blotting检测和鉴定结果，MTT比色法测定重组LT活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白；重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，活性单位相当于2105 U/L菌液。结论：为重组LT的大量生产、临床应用，为进一步研究人LT的生物学功能奠定了基础。 关键词人淋巴毒素表达大肠杆菌 中国图书分类号Q785 Expression of cDNA for human lymphotoxin in E.coli

2、 ZHANG Jin-Li，ZHU Xi-Hua. Department of Immunology,the Third Military Medical University,Chongqing 400038 Abstract Objective:To express human lymphotoxin (LT or TNF-) cDNA in E.coli.Method: A LT cDNA fragment isolated in this laboratory was subcloned into prokaryotic expression plasmid pBV220 and ex

3、pressed in E.coli DH5 by temperature shifting from 30 to 42。The expressed protein(rLT) was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis,and its cytotoxic activity on L929 cells was evaluated by MTT colorimeric assay.Results: Recombinant LT had been successfully expressed in E.coli.It has a mo

4、lecular weight 1819 kD,approximating to its molecular mass calculated from the primary amino acid sequence,and showed positive reaction with anti-LT monoclonal antibodies and cytotoxic effect on L929 cells. The expressed protein band constituted 12% of total bacterial protein and the cytotoxic activ

5、ity of rLT was 2105 U /L of E.coli fermentation broth.Conclusion:These results paved the ways for production,clinical use and researches of LT. Key wordsHuman lymphotoxinExpressionE.coli 淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)又称肿瘤坏死因子(TNF-)，它可在体内或体外特异地杀伤多种肿瘤细胞，并具有抗病毒及免疫调节活性，因其细胞毒作用与TNF-相似，而毒副作用大大低于TNF-而倍受重视，是一种非常有前途的抗

6、肿瘤和抗病毒生物制剂1。本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA2构建于原核表达载体，以期在大肠杆菌表达人淋巴毒素(rLT)。 1材料与方法 1.1pBV-LT表达载体的构建原核表达载体pBV220由中国预防医学科学院病毒所提供3，经内切酶SmaI切成双平端，同时将克隆于pUC18-LT中的去信号肽LTcDNA2经Hind/Nco I双酶切，Klenow酶填平，载体与LTcDNA按常规方法连接并转化大肠杆菌DH5，地高辛标记探针菌落原位杂交法初步筛选阳性重组子，可疑阳性重组子经酶切进一步鉴定并确定插入方向4，获得的正向阳性重组子命名为pBV-LT。 1.2人LT cDNA在大肠杆菌的诱导表达将含有

7、pBV-LT的DH5在30培养过夜，按1100稀释至LB培养液中，继续在30摇床培养至OD0.40.6，迅速转至42摇床诱生26 h，同时作未诱生菌和空载体对照3。 1.3重组人LT的检测与鉴定于诱生不同时相离心收集菌体，以1SDS上样缓冲液溶解并煮沸后行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果，并在DU-600型紫外分光光度计上作薄层扫描分析，以计算阳性蛋白带的相对比例。Western-blotting按常规方法进行，以抗LT McAb(宝灵曼产品)与转移至NC膜上的重组LT蛋白带作免疫印迹反应4。 1.4重组LT活性测定按文献方法分离包涵体4。收集42诱导5 h的细菌100 ml，

8、离心后每克湿菌加3 ml TE Buffer悬浮，超声粉碎、变性、复性后浓缩至1 ml，过滤除菌、备用。MTT比色法测定LT对培养的L929细胞的细胞毒活性5，以已知活性单位的rTNF-(本校大坪医院产品，活性单位20 000 U/ml)为阳性对照。 2结果 2.1阳性重组子的筛选与鉴定从108个pBV220/LT转化的菌落中经地高辛标记探针筛选出5个阳性菌落，质粒快速小量抽提后经RE酶切确认，这些阳性菌落均为带有插入片段的阳性重组子，其中1个为正向插入，4个为反向插入。 2.2重组LT的表达与鉴定pBV-LT经诱导后，在1819 kD处出现一新的蛋白带，其表达高峰在诱导后46 h，包涵体样品

9、在同样位置有一较浓的蛋白带，与文献报道的重组LT分子量大小一致5，薄层扫描分析表明，重组LT蛋白带占细菌总蛋白量的12%(图1A),Western-blotting显示，仅经诱导的pBV-LT在1819 kD处有阳性反应，表明前述蛋白带确属人淋巴毒素蛋白(图1B)。 2.3重组蛋白的生物学活性经MTT比色法测定，rLT与rTNF-活性单位相当，均为20 000 U/ml，此1 ml rLT为100 ml菌液所得，因此相当于2105 U/L菌液。 图1重组LT的表达与鉴定 Fig.1 Expression and identification of rLT Note:A.SDS-PAGE：Lan

10、el,protein molecular weight markers,Lanes2 and3,pellet fraction of sonicated cells carrying the control plasmid(lane2) or pBV-LT(lane3).Lanes4,6,8 and Lanes5,7,9,total cell lysate of cells harboring pBV-LT grown at 30 or 42 for 2,4,6 h respectively.Lane10,total cell lysate of cells harboring pBV220

11、grown at 42 for 4 h.B.Western blotting.Lanes1,2,3 total cell lysate of cells harboring respectively pBV220(Lane 1,grown at 42 for 4 h)and pBV-LT(Lanes 2,3,grown at 42 for 4 and 6 h) 3讨论 本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA构建于原核表达载体pBV220,筛选出的阳性重组子pBV-LT经温控诱导，成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白，该重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，其活性单位相当于2105 U/L菌液

12、。本实验为rLT的大量生产和临床应用，以及进一步研究LT的功能奠定了基础。 本实验rLT表达量占细胞总蛋白量的12%，尚有进一步提高的必要，试用合适的高效表达载体，调整SD与ATG间的距离可能是有效的途径。另外，据文献报道，人LTcDNA具有多态性，即在其成熟肽第26位氨基酸有天冬酰胺(Asn,密码子AAC)和酪氨酸(Thr，密码子TAC)之分，而26位为Thr的cDNA，其蛋白表达量明显高于该氨基酸为Asn者6，本实验克隆的人LTcDNA正好是后一种形式。因此，通过定点突变将该编码基因由AAC改为TAC，有可能提高rLT的表达水平，而建立高效的rLT纯化方法也是获得高活性重组蛋白的重要条件，

13、这些均是下一步将要开展的工作。 全军“八五”重点课题资助项目 作者简介：张津利，男，34岁，博士，主要从事细胞因子研究； 朱锡华，男，76岁，教授，博导，主要从事分子免疫学研究 作者单位：张津利朱锡华(第三军医大学免疫学教研室，重庆400038) 4参考文献 1Ruddle N H.Tumor necrosis factor(TNF-)and lymphotoxin(TNF-).Curr Opin Immunol,1992;4:327 2 张津利，朱锡华.人淋巴毒素cDNA克隆及在大肠杆菌表达的研究(博士论文摘要).第三军医大学学报，1997；19(1)：58 3张智清，姚立红，侯云德.含PR

14、PL启动子的原核表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990；6(2)：111 4金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992:602-691 5Schoenfeld H J,Poeschl B,Frey J R et al.Efficient purification of recombinant human tumor necrosis factor from Escherichia coli yields biologically active protein with a trimeric structure that binds to both tumor necrosis factor receptors.J Bio Chem,1991;266:3863 6 Messer G U,Spengler M C,Jung G et al.Polymorphic s