准分子激光兔角膜切削术后细胞凋亡和增殖

1、    准分子激光兔角膜切削术后 细胞凋亡和增殖        【摘要】目的寻找准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy,PRK）术后细胞凋亡和激活增殖的动态联系,评价激光去除上皮（phototherapeutic keratectomy,PTK)和机械刮除上皮（mechanical epithelial scrape,MES）对凋亡和增殖的影响。方法对18只兔按PTK和MES行PRK（-9.90 D,6.0 mm直径），术后定期

2、用活体共聚焦显微镜观察及制作病理切片，TdT介导dUTP缺口末端标记（TdT mediated terminal dUTP nick ending labeling, TUNEL）原位显示凋亡细胞，激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态，定量统计比较凋亡水平差别。结果PRK术后角膜基质细胞出现凋亡，程度与角膜基质细胞减少和其后增殖有关。PTK组4小时角膜基质细胞凋亡和减少水平较MES组低，1个月时激活和增殖水平亦低。结论PRK术后立即出现了角膜基质细胞减少和凋亡，其水平与后期基质细胞激活和增殖密切相关，推测基质细胞凋亡是引起创伤修复的起始因素；PTK-PRK较MES-PRK基质细胞凋亡少和减轻术

3、后激活水平。 【关键词】细胞凋亡准分子激光角膜切削术伤口愈合The apoptosis and proliferation after photorefractive keratectomyLI Yan, PANG Guoxiang, ZHAN Suhua, et al. Department of Ophthalmology, Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100730【Abstract】Objec

4、tiveTo search the correlation between the apoptosis and proliferation of keratocytes and investigate the influence of phototherapeutic keratectomy (PTK) and mechanical epithelial scrape (MES) on keratocyte apoptosis and proliferation.MethodsRabbit corneas received photorefractive keratectomy (PRK, -

5、9.9 diopters, 6mm diameter). Animals were evaluated subsequently up to 6 months after surgery by in vivo confocal microscopy. Corneas were prepared for H.E. staining, corneal cell apoptosis was evaluated by terminal deoxyribonucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) to detect D

6、NA fragmentation. ResultsLoss of keratocytes and keratocyte death were found anteriorly in the remaining stroma at 4h after PRK. Activated keratocytes observed by confocal microscopy repopulated within 1 month. A significant elevation of apoptosis was detected in keratocytes and epithelium at 4h, 3d

7、, 1m after PRK. The level of keratocyte apoptosis was parallel to the loss of keratocytes at the early stage and was correlated with keratocyte proliferation in the later stage, PTK-PRK was associated with lower levels of central corneal apoptosis and activated keratocytes than MES-PRK. ConclusionIt

8、 is suggested that the loss of keratocytes and keratocyte apoptosis be correlated with keratocyte activation and proliferation, which may result in haze and regression after PRK，and PTK-PRK induce lower level of early keratocyte apoptosis and late keratocyte activation than MES-PRK.【Key words】Apopto

9、sisPhotorefractive keratectomyWound healing准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)术后上皮下雾状混浊(haze)和屈光回退是临床上最常见的术后并发症1。相关研究表明,角膜haze和屈光回退与基质成纤维细胞的激活增殖、过度分泌有密切的关系2。通过对细胞增殖和死亡平衡机制的理解，控制伤口修复中细胞过度激活，或许有助于改善屈光性角膜手术的效果。Wilson等3研究表明，角膜上皮创伤可引起基质细胞凋亡(apoptosis)。细胞的增殖与凋亡相互平衡以维持细胞正常功能和数量稳定，在生理和病理过程中具有重要意义4。为

10、寻找PPK术后细胞凋亡和激光增殖的动态联系，评价激光去除上皮(phototherapeutic keratectomy，PTK)和机械刮除上皮(mechanical epithelial scrape，MES)对凋亡和增殖的影响，我们在兔PRK活体模型上，用角膜共聚焦显微镜动态观察其术后创伤修复反应5，同时用TdT介导dUTP缺口末端标记(TdT mediated terminal dUTP nick ending labeling,TUNEL)方法，探讨涉及伤口修复中这一可能机制6。材料与方法一、材料1. 试剂：TUNEL试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)：含TdT酶及

11、贮存液，荧光素标记的dUTP等核苷酸及反应缓冲液，羊抗荧光素抗体-碱性磷酸酶联合物；蛋白酶K(美国Merk公司)；DNA酶(美国Gibco公司)；碘化乙啶(propidium iodide,PI)(北京中山生物技术公司)；氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(nitro-blue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate,NBT/BCIP)(北京中山生物技术公司)。2. 动物：选择体重23 kg的新西兰纯种白兔18只，雌雄兼有，健康无眼病（本院动物室提供）。3. 仪器：（1）准分子激光治疗仪SVS Apex （美国Summit Tech公

12、司）；（2）角膜活体共聚焦显微镜 （日本Tomey公司）；（3）激光扫描共聚焦显微镜Ultima 212 （美国Meridian公司）。二、方法1.实验分组：将18只纯种新西兰白兔按PTK和MES随机分组，分别于术后4小时、3天、1个月及3个月各选取4只眼，另设正常对照4只眼。2动物模型建立：采用SVS Apex准分子激光治疗仪，激光参数：波长193 nm，频率10 Hz，能量密度180 mJ/cm2。按每公斤体重25 mg苯巴比妥静脉麻醉，表面麻醉剂滴眼，MES和PTK组分别去除直径为6.5mm角膜上皮，然后行PRK治疗，脉冲268，矫正-9.90 D。3共聚焦显微镜活体观察：先滴表面麻醉剂

13、，然后采用Tomey共聚焦显微镜对准角膜中心区进行扫描，放大倍数为490，行像采集处理。4组织病理切片和苏木素-伊红（HE）染色：分别于术后4小时、3天、1及3个月处死动物，立即摘除眼球，常规固定、包埋、病理切片和HE染色，光镜下观察病理形态变化。5TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)：参照TUNEL试剂盒方法，略加调整6：（1）脱蜡、水化；（2）微波修复：加入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=9)，100%功率5分钟；（3）蛋白酶K预处理：质量浓度为10 g/ml室温10分钟；（4）TdT介导的dUTP缺口末端标记：37孵育1小时；（5）PI（2.5 mg/ml，含0.1%

14、RNA酶)复染：37孵育5分钟；（5）甘油缓冲液暂时封片，激光扫描共聚焦显微镜读片；（6）加抗荧光素抗体-碱性磷酸酶联合物，37孵育30分钟；（7）加显色液(10 l NBT10 l BCIP1 ml DIG缓冲液)，避光显色10分钟；（8）终止反应，伊红轻度复染，脱水封片，光镜下读片。每次TUNEL均设立:（1）阳性对照：TUNEL前加1 g/ml DNA酶，25孵育10分钟。（2）阴性对照：仅加dUTP反应液，不加TdT。(3)正常对照。6.数据处理与统计分析：(1)活体共聚焦显微镜观察两组各时间点的基质细胞，由未参与实验的人员计数68个490倍镜下画面，单位：基质细胞数/mm2，以均值&

15、#177;标准差(±s)表示。(2)原位凋亡计数：取2组各时间点8个角膜切片，在各角膜切片中心区域随机取不重叠的10个高倍视野(490倍)，由未参与实验的人员自前到后全程角膜范围内，计数凋亡细胞总数，以均值±标准差(±s)表示。(3)数据采用SPSS 7.0软件中的方差分析和相关性分析。结果一、共聚焦显微镜活体观察PRK术后创伤修复正常角膜基质细胞排列整齐，细胞核反光弱，前基质较后基质细胞数略多，形态略不规则（1）。PRK术后4小时至3天，前基质细胞明显减少，存在低反光的空洞状无细胞区，提示手术引起基质细胞死亡，偶见小体积（<10 m）及强反光的致密结构，类

16、似于核固缩破裂（2），其下为纤长、梭形高反光的基质细胞，与其移行时呈梭形有关（3）。1个月时基质细胞呈星形，形态类似成肌纤维细胞5，具有圆形反光核，细胞密度明显增加，无梭形结构，提示细胞由移行转为静止，并重新分布于前基质无细胞区； 36个月，细胞密度及反光进一步减低，提示激活基质细胞群逐渐消失，代之以静止细胞群。1正常兔角膜前基质细胞活体共聚焦显微镜×4902PRK后4小时角膜前基质细胞活体共聚焦显微镜×4903PRK后3天角膜前基质细胞活体共聚焦显微镜×4902组在术后4小时角膜基质细胞数较正常对照显著减少（PMES=0.000 3，PPTK=0.004），术后

17、1个月基质细胞激活增生，亦较正常时差异有显著性（PMES=0.001，PPTK=0.002）（表1）。术后4小时PTK引起基质细胞减少较MES组少（P=0.004）,术后1个月时PTK组激活的基质细胞数目较MES组少（P=0.048），其余时间点2组间差异无显著性。表1共聚焦显微镜观察2组兔PRK术后不同时间角膜基质细胞的变化比较(±s，个/mm2)组别术前术后4小时*3天1周1个月*3个月6个月MES-PRK897±102336±481 072±731 110±201 314±43800±319880±100PT

18、K-PRK512±1001 104±1441 080±3051 280±27813±229966±57*方差分析：术后4小时和1个月2组与术前相比，P<0.05*方差分析：PTK与MES相比，P<0.05 二、PRK术后角膜病理形态学变化术后4小时至3天，前基质细胞明显减少，细胞核固缩，甚至出现了无细胞区（4），与前共聚焦活体观察结果一致，其下成纤维细胞激活、增生；1个月时，上皮细胞层明显增加，前基质重新有大量激活基质细胞分布，具有成肌纤维细胞的特点，胶原排列紊乱。3个月时，基质细胞逐渐恢复平静，角膜结构趋于正常。4PRK

19、后4小时兔角膜病理变化HE×200三、PRK术后角膜原位凋亡检测通过TUNEL直接检测DNA双链断裂所产生的3-羟基末端，从而在早期较灵敏的原位显示凋亡细胞。在激光共聚焦显微镜下观察的细胞经双标记荧光染色（PI、TUNEL），处于正常生长状态的 细胞核发出红色荧光，有DNA断端的凋亡细胞核则呈黄色。在结合抗荧光素抗体及NBT/BCIP显色后,光镜下凋亡胞核呈紫蓝色。在正常角膜，凋亡细胞的表达是有限的，主要在表层上皮，而在基质细胞和内皮细胞则不表达。PRK术后TUNEL阳性的细胞明显增加，不仅整个上皮，而且在基质中也可见，但主要在前基质呈散在分布，胞核固缩（约10 m），较正常细胞明显

20、缩小（56）。2组不同时间TUNEL阳性细胞，术后4小时至1个月，均较正常对照差异有显著性（P<0.05）（表2）。PTK组仅在术后4小时较MES引起凋亡细胞少（P=0.003）。表2PRK术后不同时间2组兔角膜切面*中TdT介导dUTP缺口末端标记阳性的基质细胞动态变化比较(±s，个/10个高倍视野)组别术前术后4小时*3天1个月3个月MES-PRK0.25±0.48*61±2637±1817±134±3PTK-PRK30±1625±810±111±2*每个角膜切面随机取10个高倍视野，

21、计数TUNEL阳性细胞总数*方差分析：术后4小时、3天及1个月2组与术前相比，P<0.05*方差分析：PTK与MES相比，P<0.015激光扫描共聚焦显微镜下观察TUNEL法原位标记的PRK后角膜基质凋亡细胞，呈黄荧光的TUNEL+细胞散布于红荧光的基质细胞群中6激光扫描共聚焦显微镜下观察TUNEL法原位标记PRK后的TUNEL+角膜基质凋亡细胞讨论 一、PRK术后存在着角膜基质细胞的减少和增殖角膜创伤修复过程直接影响着屈光性角膜手术的稳定性和可预测性，该过程涉及复杂的细胞和分子生物学相互作用。近年来曾有学说从细胞因子的作用等方面解释角膜细胞过度增生的机理，但却忽略了细胞死亡过程的

22、重要性，细胞生与死的平衡可能是决定角膜基质是否激活增殖从而引起haze和屈光回退的重要原因。本研究首先用共聚焦显微镜活体观察和病理形态学动态定量观察PRK术后创伤修复过程中基质细胞形态和数量的变化，结果PRK术后早期基质细胞明显减少，这与Campos等7用组织病理学方法观察结果类似。在其后长达6个月的动态观察中发现，术后1周、1个月时基质细胞数目与4小时基质细胞数呈负相关（相关性分析：1周和4小时，r=-0.84； 1个月和4小时，r=-0.82）,提示基质细胞死亡减少可能是其后基质细胞激活增殖的重要原因。二、PRK术后基质细胞的减少可能是由凋亡所介导本研究同时用TUNEL证实PRK术后角膜确

23、实存在细胞凋亡。正常角膜的凋亡细胞数量很少，主要在表层上皮，基质和内皮则偶见。正常上皮处于不断的自我更新状态：表层细胞凋亡脱落、基底增殖分化，而基质细胞则为静止细胞群，除非因损伤应激而激活。PRK术后早期可见前基质细胞的凋亡，术后4小时最高，以后逐渐降低，3个月时才与正常对照无差别，这与Mohan等8研究相似。早期基质细胞凋亡机理和意义如何?Wilson等9认为创伤上皮所释放的细胞因子IL-1，可溶性Fas-L可能是早期致基质细胞凋亡的原因，但可能还有其它细胞因子参与；多细胞生物体通过凋亡生理性清除过量的、不适当发育或损害的自身细胞，上皮损伤后的早期基质细胞凋亡可能是生物进化过程中机体自我保护

24、的一种方式。而对于创伤后期激活的基质细胞，具有成肌纤维细胞的特征10，可合成细胞骨架成分，粘附分子、细胞纤维连接素和各种胶原等细胞外基质，在创伤修复和重塑中起重要作用，这种细胞的凋亡有助于肉芽组织中细胞成分的减少，并向成熟瘢痕组织演变，如果不发生凋亡，则形成以多细胞成分为特征的增生性瘢痕11。三、PRK术后haze和屈光回退与基质细胞凋亡和增殖的关系目前研究认为，PRK术后激活的基质成纤维细胞群及其分泌过多排列紊乱的以型为主的胶原，是haze的重要原因2，本实验共聚焦显微镜活体观察也证实增强的反光来自激活的基质细胞和切削的基质面；屈光回退则与激活的成纤维细胞过度增殖，以及其合成细胞骨架等所致瘢

25、痕收缩、切削厚度回复有一定关系2,10；可见，haze和屈光回退均与基质成纤维细胞的激活增殖、数量过多有着密切的联系。本研究发现，术后4小时基质细胞凋亡数与术后4小时、1周及1个月基质细胞数的相关系数分别为-0.97、0.91及0.68，术后3天基质细胞凋亡数与术后1周及1个月基质细胞数的相关系数分别为0.73及0.84，推测细胞凋亡在早期基质细胞减少和其后增殖中起重要作用。因此，细胞生与死的平衡是决定角膜基质是否激活增生从而引起haze和屈光回退的重要原因。四、PTK和MES对PRK术后基质细胞凋亡和增殖的影响本研究对PTK和MES作用进行了评价，PTK组4小时基质细胞凋亡和细胞减少水平较M

26、ES组低，1个月时激活增殖水平亦低。推测准分子激光可在碳-碳水平上打断分子，对上皮的光切削和对其细胞因子的光分解限制了上皮的致凋亡信号传递给基质细胞。这提示PTK-PRK可减少基质细胞的凋亡，继而有助于减轻其后激活增殖，临床结果亦提示PTK-PRK较传统的MES-PRK有较少的屈光回退和修复反应12，本实验为此提供了依据。作者单位：李岩庞国祥詹素华金玉梅孙玉敏李莹李维业（100730 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院眼科）参考文献1王造文，庞国祥，郑蔚，等. 准分子激光光学角膜切削术治疗近视随诊结果分析. 中华眼科杂志, 1995,31:172-175.2Tuft SJ, Gar

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