第四章DNA复制

1、 第四章第四章 DNA复制复制 (DNA Replication) 第一节第一节 基本概念基本概念第二节第二节 复制概况复制概况第三节第三节 DNA复制的酶学复制的酶学 第四节第四节 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性第五节第五节 原核生物原核生物DNA复制（复制（E.coli） 第六节第六节 真核生物真核生物DNA复制复制 第一节第一节 基基 本本 概概 念念 ( Basic Concept ) DNA复制复制 亲代双链亲代双链DNADNA分子在分子在DNADNA聚合酶的作用下，分别以聚合酶的作用下，分别以 各单链各单链 DNADNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补分子为模板，聚合与自

2、身碱基可以互补 配对的游离的配对的游离的dNTP,dNTP, 合成出两条与亲代合成出两条与亲代DNADNA分子完分子完 全相同的子代全相同的子代DNADNA分子的过程。分子的过程。 复制子复制子（RepliconReplicon）；又称）；又称复制单位复制单位 或复制元或复制元 A unit of the genome in which DNA A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator contain a region from origin to terminator DNA中含有

3、一定复制起点和复制终点的复制单位中含有一定复制起点和复制终点的复制单位 1.3万万 90万不等万不等 复制体复制体 （Replisome） The multi protein (30 The multi protein (30) structure that ) structure that assembles at replicating fork to undertake assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA synthesis of DNA 复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同复制叉处的许多酶和蛋白组成

4、的复合体，协同动作合成动作合成DNADNA DNA 复制在细胞周期的复制在细胞周期的S S期期E.coli 37 E.coli 37 0.5 h0.5 h10105 5 bp/minbp/minmammalian cell mammalian cell 500-5000 bp/min 第二节第二节 复制概况复制概况 ( Surveys of Replication )一、一、DNA的半保留复制的半保留复制 （Semi-Conservation Replication） 1958 Meselson-stahl 设计的设计的CsCl超离心试验证实了超离心试验证实了 DNA复制的这一特性复制的这一特

5、性概念：概念： 复制过程中各以双螺旋复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模的其中一条链为模 板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子 代代DNA分子分子 15N 标记实验标记实验 细胞生长在细胞生长在15N 标记培养基中标记培养基中 转入正常转入正常N源培养基中源培养基中 分离各代分离各代DNA 分析各代分析各代DNA的浮力密度的浮力密度15N 标记标记 DNA未标记未标记 DNA CsCL密度梯度离心密度梯度离心 浮力密度浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml 二、复制起

6、点、方式和方向二、复制起点、方式和方向1、复制起点（、复制起点（origin ori或或 o 复制原点）复制原点） 复制开始处复制开始处DNA分子的特定位置分子的特定位置原核生物（原核生物（Prokaryote）：单复制起点）：单复制起点 即即整个染色体整个染色体只有一个复制单位只有一个复制单位 真核生物（真核生物（Eukaryote） : 多复制起点多复制起点 即即一个一个genome中有中有多个复制单位多个复制单位Replication fork 富含富含AT & AT & 发夹结构发夹结构 “呼吸作用呼吸作用”十分明显十分明显 许多酶的结合位许多酶的结合位点点300 bp 300 bp

7、真核生物的复制原点真核生物的复制原点AT rich 复制叉（复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活）：染色体中参与复制的活 性区域，即复制正在发生的位点性区域，即复制正在发生的位点 2、复制方向（复制过程的顺序性）、复制方向（复制过程的顺序性） 复制眼（复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的）：电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域形如一只眼睛复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子真核生物的多复制子 多个复制眼多个复制眼 （1） 单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉 单向复制单向复

8、制 双向复制双向复制（2） 复制的多模式复制的多模式 单单起点、起点、单单方向方向（原核）（原核）多多起点、起点、单单方向方向（真核）（真核）单单起点、起点、双双方向（原核）方向（原核）多多起点、起点、双双方向（真核）方向（真核） 3、复制方式、复制方式大多数以对称方式进行即两条链同时复制大多数以对称方式进行即两条链同时复制也有一定时期内也有一定时期内DNA只复制一条链的情况只复制一条链的情况 （1） 从新起始（从新起始（ de novo initiation ）或复制叉式）或复制叉式 （ replication fork ） 比较形象的比较形象的 复制复制 双链环状双链环状DNADNA的复制

9、眼可以形成一种的复制眼可以形成一种结构，形状像结构，形状像 希腊字母希腊字母，因而叫，因而叫. A replication eye forms a theta structure in circular DNA. 单、双向 复制模式图复制模式图单向复制单向复制双向复制双向复制 （2） 置换式置换式 （Displacement form ）又称）又称 D 环复环复制制 两条链的合成两条链的合成高度不对称高度不对称,一条链一条链迅速合成出互补链迅速合成出互补链,另一条则形成游离另一条则形成游离的单链环的单链环(D-环环) 线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体 DNA的复制方式的复制方式（3）共价延伸方式（

10、）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复）或滚环式复 制（制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚环结由于复制时产生的滚环结 构形状象构形状象，又称，又称复制复制 病毒、细菌因子病毒、细菌因子 第三节第三节 DNA复制的酶学复制的酶学 (Enzymology of DNA Replication) 一、一、DNA聚合反应和聚合酶聚合反应和聚合酶 1957 Arthur Kornberg 首次发现首次发现 DNApol DNApol DNApol （E.coliE.coli） 聚合反应：聚合反应： 底物底物dNTP Poly(核苷

11、酸核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷酸核苷酸)n+13-OH 2Pi 二、二、 三种三种DNA聚合酶的结构和功能（聚合酶的结构和功能（P112） 其中其中 DNApol 全酶有十种共全酶有十种共22个亚基个亚基二聚体二聚体 滑动钳滑动钳DNApol 全酶的非对全酶的非对称二聚体称二聚体 DNApol和和 DNApol 的主要特性和功能的主要特性和功能 1、 DNA聚合酶活性：两者都有聚合酶活性：两者都有 条件条件模板、引物模板、引物 DNApol主要用于主要用于DNA 的修复和的修复和RNA引物的替换引物的替换 DNApol DNA链的延长链的延长 聚合方向：聚合方向： 53 2、

12、35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性 校对功能校对功能(proofreading) 3、 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性 DNApol的的53外切活性有以下三个特点：外切活性有以下三个特点： 必须有必须有5磷酸末端磷酸末端 被除去的核苷酸必须是已经配对的被除去的核苷酸必须是已经配对的 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖糖 核苷酸核苷酸 （切刻平移，（切刻平移，Nick translation）u该反应具有巨大的实用价值，切口平移是体外在该反应具有巨大的实用价值，切口平移是体外在DNA 分子分子上引入放射性标记核苷酸的主要技术。上引入放射性标记核苷

13、酸的主要技术。4、 子链子链DNA延伸方向只能是延伸方向只能是53已知的已知的DNADNA聚合酶只能使链按聚合酶只能使链按53方向生长方向生长5 OHT C AT C A C 5 OH 3ppp OH C+ ppi P123页页 如果如果DNA的延伸方向是的延伸方向是 3 5 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G A T C G 5 ppp OH 3 A T C G + 5 ppp OH 3 G ppp OH G 5 pppa、因能量的需要，、因能量的需要， DNA的的5 端必须带有端必须带有PPP游离游离dNTP具有具有pppppp OH 3 A T C G 在在0

14、.2M NaCl 的生理环境中，的生理环境中， 使使dNTP难以聚合到难以聚合到DNA的的5端端 需要其他机制以解脱需要其他机制以解脱 b、碱基发生错配后的校正、碱基发生错配后的校正 费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗 A T C G ppp OH+ pppAp OHT C Gppp OH T C GT C Gpp p OH 三、三、 DNA连接酶（连接酶（DNA Ligase） 所需条件：所需条件： a、 切刻的切刻的 3OH 和和 5P 相邻相邻 b、 切刻各自碱基处于配对状态切刻各自碱基处于配对状态 c、 需要能量需要能量 原核（原核（ATP

15、、NAD） 真核（真核（ATP） 用途：用途： 复制过程中，复制过程中，5 端端RNA引物被置换后切刻的连接引物被置换后切刻的连接 修复、重组修复、重组NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶酶-AMP 复合物形成复合物形成 酶复合物的酶复合物的AMP和缺口的和缺口的5-磷酸磷酸相连，随后与此缺口的相连，随后与此缺口的3-OH形成形成磷酸二酯键，并放出酶和磷酸二酯键，并放出酶和AMP 四、四、 与与DNA几何学性质相关的酶几何学性质相关的酶 1、 解螺旋酶解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶又称解旋酶 是使是使DNA 两条链分开的酶，通常利用两条链分开的酶，通常利用ATP 水解提

16、供必需水解提供必需的能量。的能量。 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSB single-strand binding protein） 与单链与单链DNA结合，阻止其再形成双链状态结合，阻止其再形成双链状态 2、 DNA旋转酶旋转酶 （gyrase）：消除复制叉前进过程中：消除复制叉前进过程中 产生的正超螺旋，产生负超螺旋产生的正超螺旋，产生负超螺旋第四节第四节 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 （Semi-Discontinuous Replication） 3535OK !How ?5353 一、一、DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 事实上没有发现事实上没有发现DNA能按能按35

17、合成的证据合成的证据 岗奇片段（岗奇片段（Okazaki fragmentOkazaki fragment） 19681968 用dT-H3 短时间来标记大肠杆菌短时间来标记大肠杆菌D.S. DNA S.S. DNA 蔗糖密度梯度离心蔗糖密度梯度离心 测定测定 H3-T 放射强度放射强度得到许多长度为得到许多长度为1kb左右的左右的DNA片段片段先导链是连续复制的先导链是连续复制的后随链按后随链按Okazaki 片段不连续复制片段不连续复制 先导链（先导链（leading strand）：）：DNA复制时，与复制叉向复制时，与复制叉向 前移动的方向前移动的方向一致一致，以，以35链为模板，按链

18、为模板，按 53方向方向连续连续合成的一条链合成的一条链 后随链（后随链（lagging strand）：）：冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment): DNA复制不连续合成复制不连续合成 链中形成的短链中形成的短DNA片段片段后随链的片段合成需要一个周期性的起始信号后随链的片段合成需要一个周期性的起始信号 二、引物（二、引物（Primer）和引发酶（）和引发酶（Primase） DNA polymerase 只能使只能使DNA从引物的从引物的3端延伸端延伸 DNA复制如何起始？复制如何起始？ RNA可能提供了可能提供了DNA复制的复制的3端端1、实验证据、实验证据：M13phag

19、e 的的DNA复制显示出对复制显示出对转录抑制剂转录抑制剂 的敏感性的敏感性E.coliRif s RNApolRNApolRif S + M13E.coliM13+ S.S. DNA virus+RF无无M13 RFRifalmpinM13Rifalmpin有有M13 RF Rifalmpin Rifalmpin 是是E.coli RNA polymeraseE.coli RNA polymerase 的抑制剂的抑制剂 M13 M13 RF的形成需要的形成需要 RNA polymeraseRNA polymerase发动合成一发动合成一 段段RNA分子作为引物分子作为引物 （RNA提供复制的

20、提供复制的3端）端） RF启动后，启动后，Rifalmpin 的抑制无效的抑制无效结论（结论（Conclusion ）：）：2、实验证据、实验证据：Reiji等的实验证据等的实验证据每一冈崎片每一冈崎片 段都产生一个段都产生一个RNADNA接头接头 3、后续研究发现：、后续研究发现： 细菌中先导链的合成受细菌中先导链的合成受Rifalmpin 的抑制的抑制 后随链的合成不受后随链的合成不受Rifalmpin限制限制 （1）原因原因： 先导链的起始需要先导链的起始需要 RNApol的转录激活的转录激活 而后随链的起始由而后随链的起始由引发酶引发酶合成引物，而引发合成引物，而引发 酶不受酶不受Ri

21、falmpin的抑制的抑制（2 2） DNADNA复制的转录激活复制的转录激活 (transcriptional activation(transcriptional activation）：）： DNADNA复制起始时通过复制起始时通过RNApolymerseRNApolymerse的转录过程的转录过程 而解开局部的双链而解开局部的双链 转录激活时产生的转录激活时产生的RNA能否作为引物目前尚未得出普遍结论能否作为引物目前尚未得出普遍结论 P119页页（1） RNApol (RNA polymerase) Rif RNApol (RNA polymerase) Rif S S （2） dna

22、G (primase) Rif dnaG (primase) Rif R R 组装成引发体组装成引发体 完成对后随链（先导链）引物的合成完成对后随链（先导链）引物的合成 （3） 完成完成10 NtRNA引物合成后引物合成后 DNApo lII 进行进行DNA链的延伸链的延伸 DNApol Ligase 主要实现主要实现DNA复制的转录激活起始复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个较先导链的启动落后一个Okazaki片断片断 4、总结：、总结：RNA primed DNA replicationRemoval of RNA primers and filling of gaps复制叉如何诞生？

23、复制叉如何诞生？有机体选择有机体选择RNA作为引物的可能原因作为引物的可能原因 最终避免由于最初几个核苷酸的复制错误最终避免由于最初几个核苷酸的复制错误 导致的致死突变导致的致死突变!后随链上所包含的事件后随链上所包含的事件？ 引发体（包括引发酶）引发体（包括引发酶）ppp RNA引物引物DNA polymerase IIIpppDNA polymerase IDNA polymerase IDNAligase第五节第五节 原核生物原核生物DNA复制复制 (DNA replication in ProkaryoteDNA replication in Prokaryote) 一、一、DNA复制

24、机构的研究复制机构的研究 利用突变表型来考察基因的功能利用突变表型来考察基因的功能 但只能利用条件型突变但只能利用条件型突变温度敏感突变体温度敏感突变体 材料材料: E.coli 或噬菌体或噬菌体 二、二、DNA复制的起始复制的起始 起始方式：起始方式： a、从头起始（、从头起始（denovo initiation）: 复制、复制、D环复制、线状环复制、线状DNA的复制的复制 b、共价延伸（、共价延伸（covalent extesion） 滚环复制滚环复制（1） OriC in E. coli chromosomal DNA 1、 oriC与与 E.coli 复制的起始（从头起始）复制的起始（

25、从头起始） 四个四个9bp的重复序列的重复序列 dnaA结合位点结合位点 三个三个13bp的重复序列的重复序列（2） 简单起始过程简单起始过程 a、涉及主要酶系：、涉及主要酶系： DnaA（复制起始）（复制起始）、RNApol是必不可少的，是必不可少的，此外涉及到此外涉及到 DnaB（解旋酶）、（解旋酶）、 DnaC（引发体组（引发体组分）、分）、 Hu蛋白、蛋白、 Gyrase、 SSB、 DnaG（引物（引物酶）、酶）、Top和和 DNApol 全酶全酶 b、简单步骤：、简单步骤： * 转录激活转录激活 * DnaA 识别并结合复制起点，识别并结合复制起点，DnaBDnaC六聚六聚 体与体与oriC 形成形成预引发体预引发体 * DnaG加入形成加入形成引发体（引发体（oriC引发体）引发体），合成引，合成引 物物RNA * 引物合成后，引物合成后，DNApol 组装到引发的组