消除成品大输液中热原的方法探讨

1、消除成品大输液中热原的方法探讨摘要为消除成品大输液中的热原，对于热原不合格的成品大输液，依据内毒素限值范围，选择一定的时间，进行第二次115高温消毒以消除热原。同时发现不同品种中的热原对热稳定性有差别。10葡萄糖注射液中的热原比生理盐水中的热原，更易被第二次高温消除。应用第二次115高温消毒法在不同的时间范围内，可以消除成品大输液中相应限值的热原。关键词成品大输液；消除；热原；内毒素 Study on the Method of Elimination ofPyrogen in the Infusion SolutionHou Zhenqing,Xu Honglin,Cheng Li,Chen

2、 Enhua,Zhu Laiqing(Pharmaceutical Department of Jining First Peoples Hospital,Jining 272111)AbstractThe pyrogen in the infusion solution can be eliminated after second sterilization at 115 in acertain time based on the limit concentration of the pyrogen. It was also found that the pyrogen in differe

3、nt solution showes different stability aganist high temperature(115),the pyrogen in 10% Glucose injection is easily eliminated than that in the physiological saline by high temperature.Key WordsInfusion solution,Elimination, Pyrogen,Endotoxin大输液热原检查不合格后，通常作报废处理，由此造成的经济损失就全国来讲是很大的。因此，找到一种简单，有效而实用的方法来

4、消除热原是目前制剂工作者迫切要解决的问题之一。本文利用第二次高温法较好地解决了这一难题，由于热原是微生物的一种内毒素1，本文以内毒素检测来代替热原测定，以热原污染的规格为250ml生理盐水及10葡萄糖注射液为研究对象，现报道如下：1材料鲎试剂，灵敏度为0.5EUml，批号980803，厦门鲎试剂厂生产；内毒素标准品（RSE），批号960601，效价10EU/ml，厦门鲎试剂厂生产；细菌内毒素检查用水，内毒素含量小于0.01EU/ml，批号980905，厦门鲎试剂厂生产。756-MC型可见紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；YXQWF型卧式矩形蒸汽消毒柜，吉林市华日医疗器械厂；恒温水浴锅，上海第

5、三分析仪器厂生产；pH计，上海实验仪器厂；净化工作台，苏州净化设备厂；旋涡混合器，上海沪西仪器厂；微量移液器，上海求精生化试剂化工有限公司；除热原吸嘴，厦门鲎试剂厂；其它，稀释用毒霉素安瓶等，均按规定除热原2。2方法2.1天然内毒素的制备取微山湖中心无污染水，用蒸汽夹层锅煮沸15min，待冷至50时，经过孔径为0.8um的微孔滤膜过滤后，即得无色透明的天然内毒溶液，置冰箱中冷藏保存。2.2细菌内毒素检查法取0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶6支，其中4支加入0.1ml供试品作为供试器管，1支加入1EU/ml内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入3

6、71水浴中，保温602min后，将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转180时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（），否则为阴性，记录为（）。2.3生理盐水注射液（0.9%NS）及10葡萄糖注射液（10GS）质量检查方法参照中华人民共和国药典95版二部。2.4内毒素限值(ELC)的计算ELC稀释倍数鲎试剂灵敏度。2.5热原检测采用家兔法参照中华人民共和国药典95版二部。3结果3.1天然内毒素限值测定将天然内毒素溶液用无热原水按110，120，140，180配成倍比稀释液，采用细菌内毒素检查法即凝胶法(BET)3来测定天然内毒素溶液的内毒素限值，结果见表1。Tab 1 Determinat

7、ion of the natural endotoxin in differen t dilute solutionDilution110120140180116013201640Po sitive controlBET result+-+天然内毒内素的限值(ELC)灵敏度稀释倍数0.5320=160EU/ml。 3.2模拟内毒素不合格成品大输液制备及内毒素限值测定为筛选出成品大输液内毒素限值范围，为下一步试验作准备，设计实验操作如下：取刚灌装完未消毒的规格为250ml生理盐水及10%葡萄糖注射液各42瓶，分成7份，每份6瓶，每份依次加入天然内毒素，0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5m

8、l，6ml，在压盖后进行常规消毒(115,30min)。将上述的样品各取一瓶，用无热原水按12，14，18，116，132，164倍比稀释成各系列溶液，采用2.1的方法测定各样品中的内毒素限值，结果见表2。Tab 2Determination of the endotoxin limit concentration in sampleNatural exdotoxin(ml)0123456ELC of 0.9Ns(EU/ml)0.512481632ELC of 10GS(EU/ml)0.512481632实际工作中热原不合格的大输液其内毒素限值大都在2EU/ml以内，很少超过4EU/ml，所以

9、本课题测定的内毒素限值范围，完全能满足实际工作中的需要。3.3生理盐水及10%葡萄糖注射液第二次高温后不同时间内的内毒素消除情况固定温度(115)条件下，设定不同的消毒时间，进行第二次高温消毒，检测上述不同内毒素含量的大输液内毒素消除情况，结果见表3和表4。 Tab3 The result of eliminition of the endotoxin in0.9NS at different time after second sterilization at 115ELC(EU/ml)20min30min40min50min60min1-2+-4+-8+-16+-32+: ELC0.5EU

10、/mlTab 4 The result of eliminition of the endotoxin in10%GSatdifferent time after second sterilization at 115ELC(EU/ml)20min30min40min50min60min1-2+-4+-8+-16+-32+-:ELC0.5Eu/ml由表3、表4可以看出，内毒素限值在一定的高温条件下，随着高温时间的延长而减少。另外，内毒素在不同的介质中，对热的稳定性有差别，10葡萄糖注射液中的内毒素较之生理盐水中的内毒素经过高温后更易消除。3.4生理盐水及10葡萄糖注射液第二次高温后质量变化情况

11、如果采用第二次高温后，内毒素合格而其它检查项目如pH值、5-甲基糠醛(5-HMF)的吸收度(A)等，有一项变得不合格，本实验就没有什么意义，所以，我们对生理盐水及10葡萄糖注射液在第二次高温前后的质量变化情况进行了检测，每个条件分别测定6瓶，取其平均值，其结果见表5和表6。Tab 5 Determination of the quality of 0.9%NS afterlst and 2nd sterilization at 115in different time (n=6)Itemlst2nd2nd2nd2nd2ndStandard30min20min30min40min50min60m

12、inpH6.786.766.746.746. 726.704.57.0Content()99.6899.6899.5699.5299.4299.4095 105Tab 6 Determination of the quality of 10%GS afterlst and 2nd sterilization at 115in different time(n=6)Itemlst2nd2nd2nd2nd2ndStandard30min20min30min40min50min60minpH4.263.983.603.463.123.023.25 .55-HMF(A)0.0570.1340.1920

13、.2200.2980.33 20.32Content()99.9099.9098.8698.5097.8297.22951 05从表5、表6的结果可知二次高温后，生理盐水的质量变化不大，在设定的时间内检查项目全部合格，而10葡萄糖注射液的质量变化较明显，二次高温时间不能超过50min。3.5家兔法检验及临床验证热原是一种脂多糖，经过二次高温使其破坏后，但其破坏而成的小分子物质仍然留在液体内，其热原效应还需要用家兔法及临床作进一步验证。取我院制剂室生产的经过内毒素检测法(BET)及家兔法(RPT)检测都不合格规格为250ml的生理盐水及10葡萄糖注射液各三批，测定其内毒素限值(ELC)小于4EU

14、/ml，进行第二次115、30min高温消毒后，进行内毒素及热原测定，家兔法以三只兔子温度升高的总和(t表示)，t1.4为不合格，结果见表7。 Tab 7Determination of the endotoxin and pyrogen in 0.9%NS and 10%GSafter 2nd sterilization at 115 30min0.9NSBETRPT()10GSBETRPT()NOresultresultNOresultresult980702-0.6980403-0.7980704-0.8980418-0.4980813-0.4980526-1.0由表7可知，内毒素及热原

15、不合格的成品大输液经过二次高温消毒后，利用鲎试剂法及家兔法检测全部合格，合格率为100。二次高温消毒后的生理盐水共计4570瓶，10葡萄糖注射液共计4320瓶，经临床使用后无一例热原反应发生。 4讨论1)热原是微生物的一种内毒素，它是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物，在溶液中可能存在有两种构象即链状及团状，链状对热不稳定，而团状对热较稳定，二者处于一种动态平衡状态，且大部分以团状构象存在，因为团状构象最稳定。经过一次高温消毒后，团状构象由于获得了较多的自由能可能大部分变成了链状构象，易被二次高温所消除，但热原在不同的介质中，经过一次高温后，团状转变成链状的速率不可能一样，表现为经过二次高温后，不同介质中热原对热的稳定性有差别。2)热原对热的稳定性是相对的，二次高温可以消除一定限值的热原。对于热原不合格的生理盐水及10葡萄糖注射液，先取一瓶样品按本课题设定的稀释倍数进行稀释，由此计算出不合格大输液内毒素的限值。查找表3、表4相应的消毒时