第二章沉淀法ppt课件

1、一一 基本原理基本原理 沉淀法也称溶解度法，其纯化生物大分子的原理是根据物质的结构差异如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团比例的差异来改变溶液的某些性质如pH值、极性、离子强度、金属离子等），使抽提液中有效成份的溶解度发生变化，从而达到从抽提液中分离有效成份的目的。 蛋白质和核酸在组成、结构及性质等方面有明显差异，所以制备这两种大分子时，所用的试剂和操作方法也不完全相同。二二. .蛋白质的沉淀分离蛋白质的沉淀分离1.1.盐析的原理盐析的原理 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶；而当随盐浓度的升高而增加，这

2、种现象称为盐溶；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不种现象称为盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。的。 原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。不同蛋白质因所带电荷和水化程度不同，而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。 如血清中加

3、入50%饱和度的(NH4)2SO4可使球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到分级分离的目的通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示通常硫酸銨的添加以百分饱和度來表示 (不是浓不是浓度百分比度百分比)，例如大部分蛋白质可在，例如大部分蛋白质可在80%硫酸銨硫酸銨飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会飽和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，改变最后的总体积，很难由浓度百分比來計算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。a a 加入饱和溶液法加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需

4、调整的硫酸铵要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高浓度不高 V= V0(S2-S1)/V= V0(S2-S1)/（1-S21-S2） V:V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:V0:原溶液体积；原溶液体积；S2S2：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:S1:原溶液的硫酸铵饱原溶液的硫酸铵饱和度。和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至量的硫酸铵，加热至50506060，趁热滤去沉淀，再在，趁热滤去沉淀，再在00或室温平衡或室温平衡1 12 2天，有固体析出时

5、达天，有固体析出时达100100饱和度。饱和度。b b 加入固体盐法加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积要求：饱和度高，不增大溶液体积 g=533(S2-S1)/g=533(S2-S1)/（100-0.3S2100-0.3S2） S2S2，S1:S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；溶液的硫酸铵饱和度；g g：将：将1L S11L S1饱和度的溶液提饱和度的溶液提高到高到S2S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；饱和度时所需加进的硫酸铵克数； 实际使用时，实际使用时，g g可直接查表得到。（留意：可直接查表得到。（留意：00，2525

6、两张表，室温用两张表，室温用2525） （3蛋白质浓度 蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来共沉现象）。因此在盐析前要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在0.2-2%。 （4离子强度和离子类型的影响 a.离子强度增加，溶解度下降，盐析易发生 b.不同蛋白质盐析时所需离子强度不同，可采用分步盐析，通过逐步增加离子强度，使不同蛋白分步沉淀出来 c.离子强度相同时，高价离子，半径小的离子盐析力强 （5pH的影响 有效成分的溶解度与pH有密切关系。如甘油醛脱氢酶PI=8.5在pH6.0时能溶于3.2M/L硫酸铵溶液，当调pH到7时，立刻产生沉淀。 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶

7、液中的溶解度最低。所以盐析时溶液pH值调到等电点效果最好。 一般来说，第一次盐析除去杂质），pH应调离有效成分的pI靠近杂质的pI；而第二次盐析时沉淀有效成分时，pH应调到有效成分的pI。 （6温度的影响 在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。 一般在室温下进行盐析;温度敏感的蛋白质在低温4进展;也有个别酶在低温时失活，高温有活性,如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25比0时溶解度低，更容易盐析。 实际使用： 制备初期：pH ，温度一定，改变盐浓度离子强度）（Ks分段盐析）； 纯化，结晶：离子强度一定，改变pH，温度分段盐析）透析：透析： 透析是把待纯化的

8、蛋白质溶液装透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液在半透膜的透析袋里，放入透析液蒸馏水或缓冲液中进行的，透析蒸馏水或缓冲液中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。小分子物质降到最小值为止。 原理：利用蛋白质分子不能通过原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。子物质如无机盐、单糖等分开。5 5 脱盐脱盐 (1) 透析法 (2) 凝胶过滤法留意：留意：（1) 1) 低温操作低温操作（2 2样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；

9、过小，易产生变性，样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。回收率低。 （3 3样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pHpH，即与等电点共沉淀结合使，即与等电点共沉淀结合使用。用。（4) 4) 注意离子强度，离子种类的影响。注意离子强度，离子种类的影响。3 3、优点：、优点： 比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。比盐析法好，溶剂也容易除去。4 4、缺陷：、缺陷： 有机溶剂易使蛋白质和酶变性，必须预冷，操作有机溶剂易使蛋白质和酶变性，必须预冷，

10、操作要在冰盐浴中进行。要在冰盐浴中进行。 中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高中性盐可减少有机溶剂引起的蛋白质变性，提高分离效果，一般添加分离效果，一般添加0.05mol/L0.05mol/L的中性盐。的中性盐。 由于中性盐由于中性盐会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添会增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，故中性盐不宜添加太多。加太多。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的即操作时溶液的pHpH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。近。 （三选择性变性沉淀法：（三选择性变性沉淀法： 选择一

11、定的条件使溶液中存在的某些杂选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为蛋白变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法称为选择性变性沉淀法。选择性变性沉淀法。 例如：利用加热，改变例如：利用加热，改变pHpH或加进某些重金或加进某些重金属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，属离子等使杂蛋白变性沉淀而除去。应用此法，应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全应对欲提纯蛋白质和杂蛋白的理化性质有较全面的了解。面的了解。（四等电沉淀法：（四等电沉淀法： 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白同的蛋白质具有

12、不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。合使用。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pHpH的过的过程中，

13、要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱过酸或过碱 。 （五非离子多聚物沉淀法：（五非离子多聚物沉淀法： 聚乙二醇聚乙二醇PEGPEG），葡聚糖，右旋糖苷硫），葡聚糖，右旋糖苷硫酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。酸钠等非离子多聚物可以沉淀蛋白质和细菌。 沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，沉淀机理：空间位置排斥效应。试剂溶解度大，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，在水中占据大部分空间，将需沉淀物相互靠近，增加碰撞机率。增加碰撞机率。 优点：（优点：（1 1操作条件温和，不易引起变性；操作条件温和，不易引起变性； （2 2具有极高的

14、沉淀效率；具有极高的沉淀效率； （3 3沉淀后多聚物容易除去。沉淀后多聚物容易除去。运用：沉淀分离细菌，病毒蛋白；质粒纯化运用：沉淀分离细菌，病毒蛋白；质粒纯化 核酸类化合物都溶于水而不溶于有机溶剂。所以核酸可用水溶液提取，而用有机溶剂沉淀法沉淀分离。 从生物材料中分离出的DNA和RNA，往往是以DNA-蛋白质DNP或RNA-蛋白质RNP复合物形式存在 。因此，要制备初步纯化的核酸时，首先要分离出DNP或RNP，再将复合物解聚，除去蛋白质，然后通过沉淀法得到核酸。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中， RNP 的溶解度相当大，而DNP的溶解度仅为在水中溶解度的1%；当氯化钠的浓度达到1mol/

15、L的时候， RNP的溶解度小，而DNP的溶解度比在水中的溶解度大2倍。所以常选用0.14mol/L的氯化钠溶液提取RNP，而选用1mol/L的氯化钠溶液提取DNP。DNP DNP三、核酸的提取与沉淀分离三、核酸的提取与沉淀分离1.DNP/RNP1.DNP/RNP复合物的解聚：复合物的解聚： 主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水主要采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂来实现。解酶等试剂来实现。 去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴去污剂：在破碎细胞的溶液中，加入适量的阴离子去污剂离子去污剂SDSSDS、Triton X-100Triton X-100、Tween 40 Tween 40

16、 和和 NP-40 NP-40 等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将等，有利于膜蛋白和脂肪溶解，将DNP/RNPDNP/RNP复合物解聚，进而释放出核酸。去污剂复合物解聚，进而释放出核酸。去污剂- -蛋白质等复合物可用适量乙酸钾沉淀去除。蛋白质等复合物可用适量乙酸钾沉淀去除。 有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。有机溶剂：苯酚、氯仿等是蛋白质的变性剂。根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用根据抽提液中蛋白质的含量和溶剂的纯度，用变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水变性剂反复处理抽提液，直到离心后，上层水相含核酸和下层有机相之间的界面处无变相含核酸和下层有机相之间的界面处无变性蛋白为止。性蛋

17、白为止。蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的蛋白水解酶：用此法除去复合物中的蛋白质的操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白操作比较温和，常用的水解酶有溶菌酶、蛋白酶酶K K和蛋白酶和蛋白酶E E，可以避免剪切和破坏核酸。，可以避免剪切和破坏核酸。 2.2.多糖的消除：多糖的消除： 采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰采用动物或植物作材料提取核酸时，动物在宰杀前饥饿杀前饥饿12h12h，植物在取材前暗室培养数天，其体内，植物在取材前暗室培养数天，其体内的糖原和淀粉类物质均会减少。的糖原和淀粉类物质均会减少。 混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可用混杂于核酸提取液中的多糖类物质，一般可

18、用选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵选择性沉淀剂如异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵CTABCTAB可达到分离目的。可达到分离目的。 或用等体积的或用等体积的2.5mol/L2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积的磷酸缓冲液和等体积的乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存乙二醇甲醚处理，离心后，多糖位于中部，核酸存在上层乙二醇甲醚中。在上层乙二醇甲醚中。3.RNA3.RNA的提取：的提取： 由于由于RNARNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，是基因表达过程中非常重要的生物分子，如如mRNAmRNA携带了携带了DNADNA为蛋白质编码的信息。为蛋白质编码的信息。RNARNA的分离是的分离

19、是研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有研究基因功能的重要基础之一，在分子生物学中占有重要的地位。重要的地位。 tRNA(tRNA(约占细胞内约占细胞内RNARNA的的15%)15%)的相对分子质量较小，的相对分子质量较小，在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调在细胞破碎以后溶解在水溶液中，滤液用酸处理，调节到节到pH5pH5得到的沉淀的中可分离得到得到的沉淀的中可分离得到tRNAtRNA。 mRNAmRNA占细胞占细胞RNARNA的的5%5%左右，很不稳定，提取条件左右，很不稳定，提取条件要严格控制。要严格控制。 rRNArRNA约占细胞内约占细胞内RNARNA的的80%80

20、%，一般提取的，一般提取的RNARNA主要主要是是rRNArRNA。 RNARNA的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液的提取方法主要有稀盐溶液提取和苯酚溶液提取。提取。（1 1稀盐溶液提取：稀盐溶液提取： 将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用将细胞破碎制成细胞匀浆，然后用0.14mol/L0.14mol/L的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，的氯化钠溶液反复抽提，得到核糖核蛋白提取液，再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分再进一步与脱氧核糖核蛋白、蛋白质、多糖等分离，可得离，可得RNARNA。（2 2苯酚溶液提取：苯酚溶液提取： 在细胞破碎制成匀浆后，用在细胞破碎制成匀浆后，用SDSS

21、DS变性蛋白并抑变性蛋白并抑制制RNaseRNase活性，经多次酚活性，经多次酚/ /氯仿在一定条件下振荡氯仿在一定条件下振荡一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用一定时间，抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAcNaAc和乙醇沉淀和乙醇沉淀RNARNA，将，将RNARNA与蛋白质分开。与蛋白质分开。4.DNA4.DNA的提取：的提取： 从细胞中提取从细胞中提取DNADNA，一般在细胞破碎后，一般在细胞破碎后用浓盐法提取。即用用浓盐法提取。即用1mol/L1mol/L的氯化钠溶液从的氯化钠溶液从细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有细胞匀浆中提取脱氧核糖核蛋白，再与含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质。或者先以或者先以0.14mol/L0.14mol/L氯化钠溶液氯化钠溶液( (也可用也可用0.1mol/L NaCl0.1mol/L NaCl加上加上0.05mol/L0.05mol/L柠檬酸代替柠檬酸代替) )反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用反复洗涤除去核糖核蛋白后，再用1mol/L1mol/L氯氯化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇化钠溶液提取脱氧核糖核蛋白，经氯仿戊醇( (辛醇辛醇) )或水饱和酚处理或水饱和酚处理 ，除去蛋白质，而，除去蛋白质，而得到得到DNADNA。5. 5. 核酸的沉淀分离：