调控调节性T细胞能有效防治原因不明复发性流产

1、调控调节性T细胞能有效防治原因不明复发性流产？1、项目研究意义复发性流产是一种常见的病理性妊娠，在育龄妇女中的发病率约为1%2%。其病因除与遗传、解剖、内分泌、感染因素等有关外，仍有60%70%的患者病因不明，临床上称之为原因不明复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）1,2。该病病因不明，疗效不佳，常导致难治性不孕。由于多次妊娠和流产，给URSA患者身心带来极大痛苦，严重影响了育龄妇女的生殖健康。因此，探索其病因，寻找合适、有效的治疗方法，已成为目前生殖医学领域亟待解决的问题。目前国内外的研究公认，URSA主要与母胎免疫耐

2、受机制紊乱有关3-5， 表现为CD4+/CD8+T细胞比值异常、Th1/Th2平衡失调、NK细胞亚群失调等。但是，调控这些免疫细胞的中心环节是什么？这仍是一个不解之谜。新近研究发现，调节性T细胞（regulatory T cell, Tr）是维持机体免疫耐受的主要因素。Tr是不同于Th1和Th2的具有调节功能的T细胞亚群，其中研究得较为清楚的亚型为CD4+CD25+Tr。CD4+CD25+Tr是由Sakaguchi等于1995年首次发现的，其特征为表达CD25（IL-2受体链）这一膜分子。CD4+CD25+T细胞在不同种属呈进化保守性，对CD4+CD25-T细胞、CD8+T细胞、NK细胞、NK

3、T细胞、树突细胞等免疫细胞均具有调控作用6-8。它不仅在防止自身免疫耐受中起重要作用，而且还参与调控肿瘤免疫和移植耐受。目前生殖医学领域对Tr的研究才刚刚起步，许多问题还悬而未决。探索Tr在母胎免疫耐受中的作用及其机制、Tr与URSA的关系，并探寻其用于治疗URSA的可行性，对于URSA发病机制和防治措施的研究具有重要意义。本课题拟从临床和实验两个层面，通过整体、离体、细胞及分子等水平，全面检测URSA患者母胎界面和外周血CD4+CD25+Tr的表达和功能，研究该细胞调控母胎免疫耐受的具体机制，以及探索通过各种手段扩增或诱导该细胞的表达能否治疗URSA。本课题的实施，不仅对丰富妊娠免疫耐受学说

4、有着重要的理论意义，并且对提高育龄妇女的生殖健康、努力构建社会主义和谐社会，也有着不可低估的现实意义。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系；研究目标1. 明确Tr在母胎免疫耐受中的作用特点。2. 明确Tr /Te平衡对妊娠取向的影响。3. 探讨扩增、诱导CD4+CD25+Tr的条件。4. 探索通过调控Tr来防治URSA的可行性。与申请者研究工作长期目标的关系本课题组长期致力于免疫相关性妊娠疾病的研究，从血管舒缩因子到免疫调节，从整体器官细胞、分子水平逐步深入。尤其近年来，作为学科研究方向之一，对原因不明复发性流产（URSA）的病因、发病机制、治疗进行了有意义的探讨。本课题组最近的研

5、究发现：正常妊娠孕妇外周血CD4+CD25+Tr比率显著增加，并且在妊娠过程中呈动态变化（详见“工作基础”）。本项目拟在此基础上，通过探讨CD4+CD25+Tr与URSA的关系以及在治疗URSA中的作用，了解Tr在妊娠中的作用，丰富妊娠免疫耐受理论，并为免疫相关性病理妊娠的防治提供新的策略。因此，本项目研究是本课题组长期研究目标之一和重要组成部分。3、项目研究内容，研究方案和进度安排研究内容（一）临床研究1. 分别检测病例组（URSA患者）和对照组（正常妊娠人工流产者）外周血和蜕膜CD4+CD25+Tr的分布特点，以了解CD4+CD25+Tr数量与妊娠取向的相关性。2. 检测上述被研究者外周血

6、和蜕膜中CD4+CD25+Tr抑制自身T细胞增殖的效率，以了解CD4+CD25+Tr功能与妊娠取向的相关性。3. 检测上述被研究者母胎界面APC细胞中共刺激分子的表达水平，以了解CD4+ CD25+Tr与APC功能的相关性。4. 研究上述被研究者母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）细胞因子的表达水平，以了解CD4+CD25+Tr与Th1/ Th2平衡的相关性。（二）动物实验1. 检测不同剂量的TGF-、IL-10等细胞因子诱导CD4+CD25+Tr体外扩增的效果，以明确CD4+CD25+Tr大量扩增的最佳诱导方案。2. 检测Foxp3基

7、因转染后，CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr转化的效率。3. 检测过继转输CD4+CD25+Tr后，自然流产模型小鼠胚胎吸收率的变化，以确定CD4+CD25+Tr对妊娠取向的影响。4. 检测过继转输后CD4+CD25+Tr在小鼠全身的定位，以确定其在妊娠过程中的分布特点。5. 检测过继转输CD4+CD25+Tr后，自然流产模型小鼠APC细胞中共刺激分子的表达水平变化，以了解CD4+ CD25+Tr对APC功能的影响。6. 研究过继转输CD4+CD25+Tr后，自然流产模型小鼠母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）细胞因子的表达水

8、平，以了解CD4+CD25+Tr对 Th1/ Th2平衡的影响。研究方法（一）临床研究1. 实验分组：实验分为URSA组和正常妊娠人工流产组（正常妊娠要求人工流产病例）。免疫不耐受性流产的诊断标准为：流产病人排除夫妻双方和胚胎染色体异常，子宫解剖结构异常，内分泌异常，生殖道感染，自身免疫性疾病（抗磷脂抗体阳性、抗核抗体阳性）。2. 流式细胞术（FCM）检测CD4+CD25+Tr的比率。3. 混合淋巴细胞反应（MLR）检测CD4+CD25+Tr抑制淋巴细胞增殖的能力。4. 流式细胞术（FCM）检测母胎界面APC细胞CD80、CD86等共刺激分子的表达。5. ELISA检测母胎界面Th1型（IL-

9、2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）细胞因子表达水平。（二）动物实验1. CD4+CD25+Tr体外大量扩增：不同剂量的TGF-、IL-10等细胞因子与CD4+CD25+Tr共同孵育。2. CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr转化：构建Foxp3逆转录病毒载体，脂质体转染包装细胞PA317，筛选、扩增阳性克隆，转染CD4+CD25-T。3. 实验分组：实验分为自然流产治疗组（自然流产动物过继转输CD4+CD25+Tr），自然流产对照组。4. 肉眼计数吸收胚胎数和存活胚胎数。按下式计算胚胎吸收率(R)：R = Re /Re + F。Re为吸收胚胎数，F

10、为存活胚胎数。5. 单光子发射计算机断层扫描（SPECT）检测CD4+CD25+Tr在受体体内的归巢和分布。6. 流式细胞术（FCM）检测母胎界面APC细胞CD80、CD86等共刺激分子的表达。7. ELISA检测母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）细胞因子表达水平。技术路线（一）临床研究URSA组和正常妊娠人工流产组分离外周血、蜕膜淋巴细胞CD4+CD25+Tr比率（FCM）CD4+CD25+Tr抑制能力（MLR）Th1、Th2型细胞因子表达水平（ELISA）分离胎盘、蜕膜组织分离胎盘、蜕膜APC细胞CD80、CD86表达水平（FC

11、M）（二）动物实验诱导CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr转化自然流产动物模型体外大量扩增CD4+CD25+Tr过继转输CD4+CD25+Tr分离胎盘、蜕膜组织分离胎盘、蜕膜APC细胞CD4+CD25+Tr归巢（SPECT）胚胎吸收率Th1、Th2型细胞因子表达水平（ELISA）CD80、CD86表达水平（FCM）进度安排2006.012006.03收集临床标本；预定试剂、实验室准备；进一步完善实验设计。2006.042006.10检测临床标本中CD4+CD25+Tr的分布特点、功能变化，确定其与妊娠取向的关系和对共刺激分子、细胞因子表达水平的相关性。2006.112007.03分离、

12、纯化、体外扩增CD4+CD25+Tr；建立动物模型，过继转输CD4+CD25+Tr。2007.042007.10检测动物模型中CD4+CD25+Tr相关分子的表达水平，确定CD4+CD25+Tr对妊娠取向及共刺激分子、细胞因子表达的影响。2007.112007.12结题、成果鉴定，申报新课题或奖项。4、项目创新之处现有的研究已发现，URSA主要与母胎免疫耐受机制紊乱有关，表现为：CD4+/CD8+T细胞比值异常、Th1/Th2平衡失调、NK细胞亚群失调等。但是，调控这些免疫细胞的中心环节是什么？这仍是一个不解之谜。最近在蒙特利尔召开的免疫学国际会议上，调节性T细胞在调控免疫应答方面的作用引起了

13、与会者极大兴趣。所谓调节性T细胞(regulatory T cell, Tr)，是一类发挥免疫调节作用、维持自身免疫耐受的T细胞9。其主要通过细胞间接触抑制分泌细胞因子IL-10、TGF-等方式下调针对外来或自身抗原的免疫应答以维持免疫耐受。目前认为，CD4+CD25+Tr在维持外周免疫耐受中起关键作用，全面监控免疫系统并维持免疫系统的稳定。临床观察证实：在早、中期妊娠母体外周血和蜕膜组织中，CD4+CD25+Tr比率明显增加10；而自发性流产患者的蜕膜CD4+CD25+Tr比率则明显降低11。动物实验发现缺乏CD4+CD25+Tr可致小鼠妊娠失败12。这强烈提示CD4+CD25+Tr介导母体

14、对胎儿的免疫耐受。但是关于CD4+CD25+Tr在母胎免疫耐受中的具体作用机制和作用环节，目前研究甚少。根据现有的免疫学知识，我们假设：胚胎抗原在激活母体效应性T细胞（Te）参与免疫应答反应的同时，还刺激母体Tr分化增殖，并通过细胞细胞接触方式或分泌细胞因子抑制Te的功能，进而导致母胎免疫耐受；一旦Tr分化、发育障碍或功能减弱，或者Te生成过多，或逃逸Tr的监控则可出现流产等病理性妊娠。简言之，调节性与效应性T细胞之平衡状况是维持正常妊娠的关键。本课题将CD4+CD25+Tr引入妊娠免疫研究，从调节性T细胞这一全新的角度来研究妊娠免疫耐受的机制。并提出用“Tr/Te平衡”学说来诠释母胎免疫耐受

15、之机制。本课题还以纠正Tr/Te失衡为切入点，尝试通过调控Tr来纠正URSA，以探寻防治此种流产的新方法。从“Tr/Te平衡”角度来诠释母胎免疫耐受理论，并以此为突破口来防治URSA，国内外尚无类似报道。该假说一旦被证实，将极大地丰富妊娠免疫耐受理论，并为此类流产、妊娠期高血压疾病等一类免疫相关性病理妊娠的防治提供新的策略，从而保证了课题的先进性。5、工作基础与工作条件1、工作基础本教研室为浙江省、温州医学院两级重点学科教研室。课题负责人黄引平师从同济医科大学妇产科内分泌专家吴熙瑞和马庭元教授，自80年代末开始，致力于高危妊娠发病机制的研究。先后承担或参加了多项国家自然科学基金课题、国家“七五

16、”、“八五”等科技攻关项目；1998年引入温州医学院后又相继获得两项国家自然科学基金，具有丰富的科研经验。本课题组前期的实验已经证实：与非孕妇女比较，正常妊娠孕妇外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Tr的比率显著增高（见图1）。比较早孕、中孕、晚孕妇女的外周血淋巴细胞，发现其中CD4+CD25+Tr的比率随妊娠进展呈动态变化（见图2）。本课题拟在此基础上研究CD4+CD25+Tr与母胎免疫耐受的关系，并探索通过调控CD4+CD25+Tr来防治URSA的可行性。CD4CD25图1 妊娠妇女与非孕妇女外周血CD4+CD25+Tr比率的比较妊娠妇女非孕妇女图2 妊娠各期外周血淋巴细胞中CD4+CD25

17、+Tr的比率2、工作条件本学科实验室已具备完成本实验的基本设备，如细胞培养和分子生物学实验相关仪器。所在医院有专门从事基础研究的医科所，现已有设备配置超千万元，基本满足分子生物学、免疫学、细胞生物学、遗传学等方面研究的需要；拥有的大型仪器有：倒置相差显微镜、CO2自动调节培养箱、超净工作台、立体手术显微镜、酶标仪、分光光度计、高速离心机、流式细胞仪、PCR仪、DNA合成仪、核酸测序仪、基因相差显示系统、毛细管电泳、多种类型的电泳系统和成像系统等，能够满足本实验需要。所在医学院的实验动物中心可提供清洁级以上的实验动物及饲养条件。所需试剂材料均可从国内外公司购得。本实验室与杨焕明教授领导的华大基因

18、公司和叶笃筠教授所在卫生部呼吸系统疾病重点实验室有着很好的合作关系。因此，已具备完成本课题所需条件。6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路本课题将为母胎免疫耐受理论提供新的学说，并为防治原因不明性流产等一类免疫相关性病理妊娠提供新思路。本课题的完成，有望使调控Tr成为防治母胎免疫耐受异常的有效手段，为攻克复发性流产和难治性不孕这些医学难题提供新的途径，给临床上此类不孕患者带来福音。研究成果预计可在国内外杂志上发表较高水平的学术论文46篇，并申报相关成果奖。本项目还将协助培养硕士生34名，博士生12名。7、参考文献1. Whitcomb DJ. Abortion surveill

19、ance. AWHONN Lifeline, 2004, 8(2):112-114.2. 林其德。URSA的基础与临床研究进展。中华妇产科杂志，2003，38（8）：481-483。3. Aluvihare VR, Kallikourdis M, Betz AG. Tolerance, suppression and the fetal allograft. J Mol Med, 2005, 83(2):88-96.4. Carp H. Cytokines in recurrent miscarriage. Lupus, 2004, 13(9):630-634.5. Chaouat G, Le

20、dee-Bataille N, Dubanchet S, et al. Reproductive immunology 2003: reassessing the Th1/Th2 paradigm? Immunol Lett, 2004, 92(3):207-214.6. Fallarino F, Grohmann U, Hwang KW, et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat Immunol, 2003, 4(12):1206-1212.7. Trzonkowski P, Szmit E,

21、Mysliwska J, et al. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol, 2004, 112(3):258-267.8. Earle KE, Tang Q, Zhou X, et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin Immunol, 2005, 115(1