安络小皮伞菌丝体多糖的提取及其抗氧化性研究

1、 No.12.2006安络小皮伞(Marasmius androsaceus 系担子菌纲、伞菌目、白蘑科小皮伞属真菌。它的药用价值较高,我国民间用它的菌丝来治疗跌打损伤、骨折疼痛、坐骨神经痛、偏头痛、麻风性神经痛和风湿关节痛等1。安络小皮伞多糖是安络小皮伞的重要活性成分,本文就其多糖成分进行了系统地研究,通过液体深收稿日期:2006-05-15*通讯作者基金项目:全国教育科学“十五”规划教育部重点项目(批准号DIA030165。作者简介:王曦(1983-,女,黑龙江齐齐哈尔人,主要从事生物化学方面的研究工作。安络小皮伞菌丝体多糖的提取及其抗氧化性研究王曦,梁启明,李婷婷,职润,张娜,逯家辉*(

2、吉林大学生命科学学院,长春130012摘要:研究将正交试验应用于安络小皮伞菌丝体多糖水浸提工艺的探索,求得最佳水浸提工艺条件为料水比115、提取温度70、提取时间2h 、提取次数2次。提取的粗多糖用乙醇对其进行分级沉淀,以各级乙醇沉淀所得多糖和为100%计,当乙醇的体积为提取液体积的4倍时,多糖沉淀量最大为39.61%。对OH 和O -2的清除作用试验表明,安络小皮伞多糖对OH 、O -2均有较好的清除作用。4倍醇沉多糖对OH 的清除率可达49.72%。1倍醇沉多糖对O -2的清除率可达42.22%。关键词:安络小皮伞菌丝体多糖;水浸提;正交试验;抗氧化性中图分类号:TS201文献标识码:A文

3、章编号:1005-9989(200612-0080-03Study on extraction and anti-oxidation ofmarasmius androsaceus mycelium polysaccharidesWANG Xi,LIANG Qi-ming,LI Ting-ting,ZHI Run,ZHANG Na,LU Jia-hui *(College of Life Science,Jilin University,Changchun 130012Abstract:Water extraction process of Marasmius androsaceus myce

4、lium polysaccharides was studied bymeans of the method of orthogonal experiment.The results showed that the optimum extraction conditions were 70,2h,the ratio 1:15(w/vand 2times.The extracted rude polysaccharides then were purified by method of ethanol fractional precipitation.Given the total yield

5、of the fraction productions was 100%,when the quantity of ethanol was 4times the volume of polysaccharides filtrate,the yield of the fraction productions was up to39.61%.The results of anti-oxidative experiments show that the elimination of the fraction productions to O -2and OH were pretty high.Whe

6、n the quantity of ethanol was 4times the volume of polysaccharides filtrate,the elimination rate of the production to OH could reach the highest value of 49.72%.When was 1times,the elim-ination rate of the production to O -2could reach the highest value of 42.22%.Key words:Marasmius androsaceus myce

7、lium polysaccharides;water extraction;orthogonal experiment;anti-oxidation80 No.12.2006层发酵获得安络小皮伞菌丝体,对其多糖水浸提的条件进行正交试验优化,以提高多糖得率。提取的粗多糖经纯化,进行对OH 和O -2的清除作用试验,为安络小皮伞多糖体外抗氧化活性提供一定的参考依据。1材料与仪器安络小皮伞菌种:实验室筛选保存;蒽酮、硫酸、邻苯三酚、番红花红、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2和硫酸亚铁:国产分析纯;UV-3150型紫外可见近红外分光光度计:日本岛津;5810R 型高速冷冻离心机:德国Eppendor

8、f 公司;恒温水浴锅;冻干机;透析袋(截留分子量10000;电子天平等。2实验方法2.1标准曲线的制作采用蒽酮-硫酸法2,以葡萄糖为标准品制备标准曲线。精确称取分析纯葡萄糖0.01g ,用蒸馏水溶解,定容至250mL ,分别取0.3mL 、0.6mL 、0.9mL 、1.2mL 、1.5mL 置于试管中,加水补至2mL ,另以2.0mL 蒸馏水作空白对照。分别加入2g/L 蒽酮试剂4.0mL ,迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后一起浸于沸水浴中,管口加盖,精确反应10min ,用自来水冷却,室温放置10min ,于620nm 比色。2.2菌丝体多糖的提取方法液体深层发酵获得安络小皮伞菌丝体,冷冻

9、干燥至恒质量,粉碎机破碎,过60目筛。分别称取菌丝体干粉1g ,加蒸馏水在恒温水浴锅内浸提一定的时间。4000r/min ,4,20min 离心,上清液转移至50mL 容量瓶中,定容。分别取20L 进行多糖含量的测定。在提取过程中,很多因素影响多糖的提取率,主要是料水比、提取温度、提取时间、提取次数,选取影响多糖提取效果的因素料水比、提取温度、提取时间,进行了L 9(33正交试验(见表1,对正交试验结果进行分析,找出最佳提取条件。按最佳提取条件提取,考查提取次数对提取率的影响。2.3粗多糖的纯化酶法除蛋白:水提上清液37水浴加入活力单位为1250U 的胰蛋白酶100mg ,反应6h 除蛋白。S

10、evage 液除蛋白3:用氯仿正丁醇(体积比=41的Sevage 试剂除蛋白,按糖液Sevage 液(体积比=51将两液混合于分液漏斗,充分震荡,静止,分液,除去有机层及蛋白乳化层,反复多次,直至蛋白层不再出现为止。乙醇分级沉淀:除蛋白后的上清液分别用0.4、1、2、4倍体积的乙醇沉淀出多糖4,4000r/min ,4,20min 离心,沉淀用少量水溶解放入1万的透析袋中透析4d ,每12h 换一次水,除去小分子量的单糖,测定透析后糖溶液中多糖含量并计算多糖总得率。多糖总得率(%=各级沉淀多糖量之和/菌丝体干粉质量×1002.4多糖含量测定蒽酮-硫酸法2。2.5多糖对OH 的清除作用

11、采用亚铁离子催化过氧化氢产生OH(根据Fenton反应原理5,由于OH 可特异地使番红褪色,根据褪色程度用比色法来衡量OH 的含量。反应体系中加入0.15mol/L pH7.4磷酸缓冲液1.5mL ,番红花红(260g/mL0.2mL ,0.56mmol/L EDTANa 2-Fe(0.7mL(新鲜配制,再加入一定浓度的各级多糖样品0.8mL ,最后加入1%H 2O 20.8mL(新鲜配制,混匀后于37水浴保温30min ,在波长520nm 处测吸光度A 值。空白组以蒸馏水代替样品溶液,对照组以蒸馏水代替样品溶液和EDTANa 2-Fe(溶液,实验结果以清除率E%表示,计算公式如下:E(%=(

12、A 样品-A 空白/(A 对照-A 空白×100式中:A 样品安络小皮伞多糖液吸光度值;A 空白空白组吸光度值;A 对照对照组吸光度值。2.6多糖对O -2清除作用采用邻苯三酚自氧化法6,在一定条件下,邻苯三酚能够自氧化产生O -2,加入一定量的多糖液可对O -2产生不同的抑制作用,进而导致光吸收值的变化。取pH 为8.2的Tris-HCl 缓冲液6mL 于试管中,分别加入一定浓度的各级多糖样品0.5mL ,37水浴10min ,最后加入37预热过的7mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液1mL ,混匀,精确反应4min ,立即用0.5mL 浓盐酸终止反应,测320nm 处吸光度值。对照组以

13、Tris-HCl 缓冲液代替糖液。实验结果以清除率E%表示,计算公式如下:E(%=(A 对照-A 样品/A 对照×100式中:A 样品安络小皮伞多糖液吸光度值;A 对照对照组吸光度值。水平因素温度(A时间(hB料水比(w/vC160111027021153803120表1正交实验因素水平表81 No.12.20063结果与讨论3.1标准曲线的制作蒽酮-硫酸法测定多糖含量的标准曲线如图1所示。得回归方程:y=0.0089x+0.0019,r=0.9992式中:x 多糖含量,g ;y 吸光度OD 620,nm 。3.2安络小皮伞多糖提取条件的优化对影响多糖提取效果的因素,即料水比、提取温

14、度、提取时间,进行了L 9(33正交试验(见表2,对正交试验结果进行分析,找出最佳提取条件。根据表2的极差分析,可排出各因素的顺序:C(料水比>A(提取温度>B(提取时间,说明在各因素中,料水比对多糖提取率影响最大,温度次之,然后是提取时间。因素A 、B 、C 均以第二水平为最好。因此,安络小皮伞多糖的提取优化条件为A 2B 2C 2,即最佳提取温度为70、最佳提取时间为2h 、最佳料水比为115。按最佳提取条件进行提取,得提取率为8.568%,再进行第二、三次提取,提取率分别为1.464%和0.059%。以3次提取的多糖和为100%,第一次就提取出大部分的多糖为84.91%,第二

15、次提取出14.51%,第三次为0.58%。尽管提高提取次数可以增加多糖的提取率,但从经济角度看并不合算。因此,选择两次提取较合适。3.3乙醇分级沉淀得多糖含量60g 安络小皮伞菌丝体按最佳提取条件提取2次,经乙醇分级沉淀,透析后,用蒽酮-硫酸法测定各级醇沉多糖含量,并计算多糖总得率,结果见表3。从表3可看出,乙醇加入体积为提取液体积4倍时多糖得率最高,占总多糖的39.61%。多糖总得率为5.93%。3.4各级多糖对OH 的清除作用各级多糖溶液分别稀释成0.4mg/mL 进行实验,对OH 的清除作用以清除率E%表示,结果见表4。从表4可看出,随着乙醇加入倍数的增大,其分级产物对O -2的清除能力

16、增强,当乙醇用量达4倍体积,产物浓度为0.4mg/mL 时对OH 的清除率可达49.72%,说明安络小皮伞多糖对OH 有很强的清除作用。3.5各级多糖对O -2的清除作用各级多糖溶液分别稀释成2g/mL 进行实验,对O -2的清除作用以清除率E(%表示,结果见表5。由表5可见,乙醇分级的各级产物对O -2的清除作试验号因素A 620ABC 11110.31821220.33831330.30242120.32352230.33262310.30673130.30183210.28493320.327K 10.9580.9420.908K 20.9610.9540.988K 30.9120.93

17、50.935k 10.31930.31400.3027k 20.32030.31800.3293k 30.30400.31170.3117R0.01630.00630.0176C>A>B表2正交实验结果醇沉倍数多糖量(g多糖量/总多糖量(%0.40.226.1811.0328.9320.9025.2841.4139.61表3各级醇沉多糖含量醇沉倍数多糖浓度(mg/mLA 样品A 空白A 对照清除率E(%0.40.40.4940.3000.82736.8110.40.5030.3000.82738.5220.40.5390.3000.82745.3540.40.5620.3000.8

18、2749.72表4各级多糖对OH 的清除率醇沉倍数多糖浓度(g/mLA 样品A 对照清除率E(%0.420.2460.33426.35120.1930.33442.22220.2110.33436.83420.2210.33433.83表5各级多糖对O 2-的清除率82 No.12.2006用有所差异,当乙醇用量为1倍体积时,多糖对O -2的清除率最大,为42.22%。4结论本研究结果表明,料水比是影响安络小皮伞多糖提取率的主要因素,其次为提取温度,提取时间。安络小皮伞多糖提取的最优条件为料水比115、提取温度70、提取时间2h 、提取次数2次。各级多糖溶液对OH 、O -2均有清除作用。对O

19、H 的清除作用随着乙醇加入倍数的增大而增加,乙醇用量是提取液体积的4倍,多糖浓度为0.4mg/mL 时,最大清除率可达49.72%。当乙醇用量为提取液体积的1倍,多糖浓度为2g/mL 时对O -2的清除率最大,为42.22%。参考文献:1叶文博,杨晓彤,陈莹.安络小皮伞对大鼠的长时效镇痛作用J.中药药理与临床,2002,18(4:19-212张惟杰.糖复合物生化研究技术M.杭州:浙江大学出版社,2003:12-133滕利荣,孟庆繁,刘培源.酶法提取百合多糖及其体外抗氧化活性.吉林大学学报(理学版,2003,41(4:538-5424谭仁祥.植物成分分析M.北京:科学出版社,2002:559-5605李平,王艳辉,马润宇.山茱芋多糖PFCA 的理化性质及生物活性研究J.中国药学杂志,2003,38(8:583-5866沈齐英,沈秋英.北虫草抗氧自由基和羟基自由基作用的研究J.广西植物,2001,8(3:252-254收稿日期:2006-05-16*通讯作者作者简介:肖海芳(1980-,女,山东菏泽人,讲师,硕士,研究方向为天然