RGS与G蛋白信号转导的调节

1、    RGS与G蛋白信号转导的调节          摘要RGSs（regulators of G-protein signaling）是最近发现的G-蛋白信号转导的负调节子，大部分RGSs通过GAPs（GTPase activating proteins）方式发挥作用，RGS的作用具有高度特异性，在体内受到严密的调节。对RGS的深入研究有利于对信号转导调节的了解。关键词RGS；G蛋白；GAP；信号转导学科分类号Q7; R329.2RGS and the Regu

2、lation of G Protein Signal TransductionCHEN Xing-Yun,ZHOU Yuan-Guo(Molecular Biology Center, Research Institute of Surgery and DaPing Hospital,Third Military Medical University, Chongqing 400042)AbstractRegulators of G-protein signaling (RGSs）are recently identified negative regulator of G-protein s

3、ignaling, most of the RGSs act as GTPase activating proteins (GAPs）. RGSs can selectively act on Gs and their effects are scrupulously regulated in vivo. It is believed that we can learn more about regulation of signal transduction from the development of research on RGSs. Key wordsRGS；G-protein；GAP

4、；Signal transduction配体与细胞表面的G蛋白（Guanine nucleotide-binding protein）偶联受体结合，受体激活后刺激核苷交换和G蛋白亚基和亚基复合体解离，解离后的亚基激活多种效应器，从而引起生物化学和细胞生理的改变，这是生物体内普遍存在的一种信号转导机制。但机体如何调节信号转导的强度和持续时间以达到对刺激的最适反应？G蛋白信号转导调节子（regulators of G-protein signaling）是最近发现的细胞内GTP酶（GTPase）激活蛋白（GTPase activating proteins，GAPs），它可加速G水解GTP，从而限

5、制G蛋白激活的强度和持续时间，调节信号转导过程。随着研究的深入，RGSs在信号转导过程中的作用越来越受到人们的重视。一、G蛋白循环的激活与失活激动剂与受体结合，引起受体结构改变，激活G蛋白，G亚基释放二磷酸鸟苷(GDP)结合GTP。GTP结合改变了G亚基三个“开关”(switch)区的结构，促使G解离1，同时发生鸟嘌呤核苷交换。激动剂激活的受体可加速鸟嘌呤核苷交换，G结合减缓鸟嘌呤核苷交换。失活需要G亚基结合的GTP水解，使G亚基易于与G亚基重新结合，阻断信号的进一步转导。GTP水解的重要性促进了对激活G亚基GTPase活性因子的研究，尤其是对GAPs的研究。效应器酶可以起这种作用：磷脂酶C在

6、体外可以刺激G的GTPase活性2，cGMP磷酸二脂酶亚基刺激Gt水解GTP（Arshavsky等.1992）。最近的研究发现，大部分RGS蛋白是Gi和Go的GAPs。二、RGS蛋白家族Dohlman(1996)等最初发现，啤酒酵母RGS蛋白是G蛋白信号转导的负调节子。随着哺乳动物RGS蛋白与Gi3相互作用的证实，RGS迅速引起了人们的重视。到目前为止，已经发现20种哺乳动物基因编码具有RGS核心区域的蛋白。通常情况下，这种120氨基酸的核心两端具有高度可变的臂，三者共同构成一个25kD的蛋白质分子3。RGS4和Gi1-GDP.ALF-4晶体结构中3，只有RGS的核心区域是可见的，已经证实该区

7、域含有RGS4作用的所有元件4，RGS4核心区包含一个典型的右手性反平行4-螺旋束，它与Gi1的“开关”区、相互作用。G蛋白的“开关”和区域残基与GTP的结合和水解密切相关，RGS4不提供与GDP或ALF-4直接作用的任何残基。但RGS4的保守天冬酰胺（Asn128）残基可以在基础状态与水解的水分子或Gi1的谷氨酰胺（Gln204）残基侧链相互作用，该残基确定方向并使过渡状态中催化反应的水极化，提示RGS4通过稳定过渡状态G蛋白结构中的“开关”区起GAP作用，降低激活的能量障碍；Asn128可能通过与水或Gln204相互作用进一步促进水解。Coleman5等发现，在Gi1*GppNHp的活性部

8、位，一个水分子分别与Glu43侧链和磷酸基的氧原子形成氢键。催化残基Gln204侧链的结构与GTP-和GDP*ALF-4复合物中的结构明显不同。氢结合和空间作用决定了Gln204的位置，它与亲核的水分子相互作用，呈现一种“自我抑制”状态，RGS可能部分是通过在Gln204占据的位置插入氨基酸侧链释放Gln204，破坏G的“自我抑制”状态而启动其GTPase活性。三、RGS蛋白的作用方式RGS蛋白是G蛋白信号转导的负调节子，在解离的G亚基、G亚基或以上水平发挥作用（不作用于以下水平）。最容易想到的是，RGS蛋白可能抑制GDP的解离而阻断G蛋白激活或激活GTP酶加速G蛋白失活。目前尚无支持前一种机

9、制的证据，已发现的哺乳动物RGS蛋白大部分以GAPs的方式发挥作用。（一)RGS蛋白的GAPs作用在无受体状态下，G蛋白水解GTP稳态的限速步骤是产物的释放（即GDP的解离）。要检测RGS对GTP水解的作用，必需绕过限速步骤或使其充分加速。第一种方法需要制备底物（GTP-G），在无Mg2+状态下孵育G蛋白和GTP，然后分别在无RGS和有RGS状态下加入Mg2+启动催化反应，通过典型的几秒或几分钟的时间过程监测GTP水解的一个循环。或者在磷脂囊内将G蛋白与受体重新偶联，通过加入受体激动剂加速产物降解，然后就可以测定GAP对GTP水解稳态的加速作用。目前发现大部分RGS蛋白是Gi和Go的GAPs6

10、。（二)RGS蛋白的效应器拮抗作用如前所述，RGS4与Gi1的“开关”区域结合。从理论上来讲，这些区域也参与了与效应器的结合，这种结合表面的接近或重叠提出了这样一种可能性：RGS蛋白能够与效应器竞争结合G。目前已经观察到RGS4可与磷脂酶C竞争结合GTPS-Gq7；另外，RGS4和G作用蛋白(GAIP)都可以阻断GTP-S诱导的百日咳毒素非敏感性磷脂酶C激活。由于RGS不刺激G蛋白水解GTP-S，GAP机制可能无效。RGS4在COS-7细胞中短暂表达，但它可以阻断ALF-4诱导的磷酸肌醇合成，这也与效应器拮抗机制一致8。在RGS蛋白、Gt和效应器（视网膜cGMP磷酸二酯酶）也观察到类似的结果9

11、。竞争性阻断效应器与G蛋白的结合并不是RGS蛋白负调节G蛋白信号转导的有效机制。RGS4与G蛋白相互作用的时间是短暂的，并且它本身通过GAP机制足以阻断信号转导。RGS4对GDP结合的G蛋白亲和力低，可能不足以阻断G的再循环。然而RGS蛋白家族的其它成员很可能对GTP或GDP结合的亚基具有很高的亲和力。这些蛋白在理论上可以作为效应器的拮抗剂或亚基的螯合剂，从而使亚基不能与效应器或亚基相互作用。上述两种机制中的任何一种均有与GAP机制不同的结果：简单刺激GTPase的活性使其失活并与结合，进而阻断下游的相互作用。其它两种机制将会阻断G的信号转导，但亚基的信号转导途径是完整的。但Tapan等（19

12、97）研究发现，尽管RGS4和腺苷环化酶都结合于G的“开关”II区，但这两种相互作用可以同时进行，表明在某些情况下，RGS蛋白与效应器结合部位的重叠并不能直接说明RGS蛋白是效应器的拮抗剂。(三)RGS蛋白与G的作用在无受体激活状态下，RGS3和RGS4诱导G调节的K+通道内流增加10。用百日咳毒素或胆碱能受体阻断剂消除激动剂诱导的K+内流，但不改变RGS的作用。细胞内共转染G-结合蛋白显著降低RGS4诱导的基础K+内流。RGS蛋白也改变另外一种G效应器N型Ca2+通道的性质。提示RGS3和RGS4也具有调节G二聚体信号转导的作用。四、RGS蛋白作用的特异性及其结构基础(一)RGS蛋白作用的特

13、异性RGS蛋白的数量可与G亚基相比，因此RGS蛋白与G相互作用具有高度的特异性。GAIP和RGS4可以选择性地分别加速Go-和Gi3通路的脱敏作用，GAIP和RGS4抗体可以选择性地减缓上述两通路的脱敏作用11。GAIP可以选择性地作用于Gi家族成员，对Gi1、Gi3和Go的作用强，对Gi2的作用弱，不与Gs作用12。RGS7为大脑特异性RGS，其mRNA主要在小脑皮质粒细胞层中的高尔基氏细胞内表达，RGS7加速G蛋白偶联内向整流钾通道(GIRK)电流激活的作用与RGS8相同，但加速失活的作用显著弱于RGS813。RGSZ1是大脑选择性RGS，它对GZ的选择性比对Gi1高100倍，RGSZ1的

14、其它酶学特征与GzGAP和RET-RGS1相同，没有明显的跨膜区，但它在大脑内可与膜牢固结合，这与它本身的疏水特性有关（Wang等.1998;Glick等.1998）。GZ磷酸化抑制RGSZ1的GAP活性，但不改变GZ-GTP水解的基础速率，只是其GAP活性显著降低，GAP抑制可以使Gz信号延长放大许多倍。RGS4以受体特异性方式抑制磷脂酶C活性和Ca2+信号的转导。RGS1和RGS16也以受体选择性方式抑制Gq依赖性Ca2+信号的转导。RGS的受体选择性作用提示RGS调节特异性是通过RGS与受体复合物相互作用实现的14。(二)RGS蛋白作用特异性的结构基础关于RGS蛋白作用特异性的结构基础对

15、于RGS和G是不同的，G的C-末端和RGS的N-末端均参与了RGS的特异性作用。由Gi2N-末端和Gi1C-末端构成的蛋白与GAIP作用的强度与内源性Gi1相同。而由Gi1N-末端和Gi2C-末端构成的蛋白不与GAIP作用，表明决定GAIP选择性作用的部位位于G蛋白GTPase区域的C-末端。点突变证实，当Gi1ASP229突变为ALA时，GAIP结合能力几乎完全丧失，而当Gi2相同位置的ALA突变为ASP时，其对GAIP的结合强度与内源性Gi1相同，表明ASP229对Gi1结合GAIP具有重要意义14。RGS4的N-末端区对于其选择性作用是必不可少的，消除N-末端后RGS4的受体选择性消失。

16、当把RGS4盒与N-末端肽一起加入时，受体选择性部分恢复。所以RGS4盒加速GTP水解，N-末端提供高亲和力和受体选择性抑制。缺乏N-末端的RGS16不能与细胞膜结合，其第732个氨基酸区域足以提供细胞膜打靶（membrane-targeting）活性，其中第1230个氨基酸形成双亲性的-螺旋，螺旋表面的非极性疏水残基和位于螺旋极性与非极性交界面的阳离子侧链对于RGS与膜结合至关重要15。RGS9参与光感受器特异性蛋白（转导素）GTPase活性的过程。在脊椎动物光感受器中，RGS9与G5l形成牢固的复合体16。Snow BE（1998）等发现，RGS11在DEP区（Dishevelled/Eg

17、l-10/Pleckstrin)和RGS区之间有一个G样区域，RGS11与G5形成复合体，RGS11/G5二聚体以GAP方式作用于Go，且具有明显的选择性。RGS7与G5形成牢固的复合体，G5和RGS7重组蛋白在体外也可形成复合物。RGS7与G5相互作用的特异性由RGS蛋白上的G样区域决定，消除该区域后阻断了RGS7与G5的结合；用G1的成分代替RGS7的G样区域后，RGS7可与G1特异性结合。RGS7与G5相互作用阻断了RGS7与Go结合，表明G5是RGS7的特异性抑制剂17。五、RGS的调节RGS蛋白的作用表明它们在体内受到严密的调节，调节可通过多种机制完成：（一)效应器对RGS蛋白作用的

18、调节RGS9可以和下游的磷酸二酯酶协同刺激转导蛋白G亚基的GTPase活性，且对Gt具有高度特异性RGS9的核心区域可使GtGTPase活性升高10倍，而Gi1GTPase活性仅升高2倍。Gt的螺旋区是RGS9特异性作用的结构基础。RGS9的作用与其对激活的Gt的亲和力密切相关，磷酸二酯酶的亚基可以增加RGS9对Gt的亲和力，因此可以增强RGS9的GAP活性18。(二)十六烷基化调节十六烷基化对哺乳动物细胞和酵母细胞RGS作用的调节可能不同，因为在酵母细胞中，十六烷基化缺陷的RGS4仍具有活性，并能进行细胞膜定位。另外，酵母细胞中RGS16与膜结合并不需要十六烷基化15。但十六烷基化在哺乳动物

19、细胞RGS蛋白的调节中具有重要意义，2和12半胱氨酸残基突变可以阻断RGS16的十六烷基化，在无细胞体系中，半胱氨酸突变的纯化RGS16仍能起激活Gi的作用。十六烷基化抑制或降低并不显著改变与细胞膜结合的蛋白量。然而，当十六烷基化缺陷的变异RGS16在HEK293T细胞表达时，抑制Gi和Gq偶联信号通路的能力减弱19。这些结果表明，RGS16的N-末端区域可能影响活体内这些蛋白与G亚基的亲和力，或者十六烷基化使RGS蛋白定位于细胞膜上紧靠G亚基的位置。(三)RGS蛋白降解RGS7通过蛋白酶体途径降解，RGS7的降解受多聚胱氨酸C-末端区域相互作用的抑制，多聚胱氨酸C-末端的膜状表达使RGS7重

20、新定位，表明快速降解和与完整膜蛋白相互作用可能是调节RGS蛋白的方式20。此外，RGS转录调节、及RGS的亚细胞定位等在RGS蛋白的调节中也具有重要作用。六、展望目前对RGS的研究还只是初步的，因此也只能简单描绘出RGS的作用、作用机制及其调节，相信随着研究的不断深入，对其功能也会有进一步深入的了解。例如：RGS的细胞内分布及翻译后调节对RGS蛋白的作用有何影响？疾病发生发展过程中RGS的含量及其功能有无变化？有何变化？这种变化在疾病发生发展中有何意义？上述这些问题的阐明将有利于对RGS蛋白的作用及其机制，以及疾病发生发展过程中RGS的作用有深入的了解，也为从信号转导角度研究疾病提供了新的途径

21、。陈星云（第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心 ，重庆 400042）周元国（第三军医大学大坪医院野战外科研究所分子生物学中心 ，重庆 400042）参考文献1，Lambright DG,Sondek J, Bohm A, et al. A crystal structure of a heterotrimeric G protein.Nature,1996,379311319.2，Chidiac P, Ross EM Phospholipase C-beta1 directly accelerates GTP hydrolysis by galphaq and accelerat

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