Taq DNA 聚合酶的热纯化制备

1、Taq DNA 聚合酶的热纯化制备摘要 目的提高Taq DNA 聚合酶的制备效率。方法利用Ni 柱亲和色谱纯化载有6xHis 标记的Taq DNA 聚合酶，并重组载体，利用Taq DNA 聚合酶的耐热特性，对粗提液 75 处理 1 h，之后通过 PCR 试验验证制备酶液的活力。结果所获重组的 pET-32A-Taq 能够在 BL21( DE3) 宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白，获得了活力远高于购买的 Taq DNA 聚合酶的酶制剂。结论使用热纯化法制备的 Taq DNA 聚合酶工艺简单，成本较低，能满足常规大量 PCR 实验要求。关键词 Taq DNA 聚合酶; 热纯化; pET-3

2、2A; BL21( DE3)Taq DNA 聚合酶由水生嗜热菌( Thermus aquatics) YT-1菌株中分离而得。该菌由 Brock1从美国黄石公园温泉中分离，作为嗜热杆菌的标准菌株，其生长温度为 70 75 。1988 年 Saiki 等2 3从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的另1 株水生嗜热杆菌( Thermus aquaticus) 中提取了1 种耐热 DNA 聚合酶，比活为 20 万 U /mg 的纯酶，分子量为93 910 D。与大肠杆菌聚合酶 I Klenow 片段相比4，该酶具有以下特点: 耐高温。在70 下反应2 h 后其残留活性大于原来的90%，在 93 下反

3、应 2 h 后其残留活性是原来的60% ，在 95 下反应 2 h 后其残留活性是原来的 40% 。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度( 20 kb)5。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌聚合酶 I Klenow 片段区别，将该酶命名为 Taq DNA 聚合酶( Taq DNA Polymerase) ，它只有1 个亚基。用 Taq DNA 聚合酶代替大肠杆菌 DNA 聚合酶 I的 Klenow 片段，是使 PCR 普及应用的关键。Taq DNA 聚合酶增进了 PCR 的特异性、产量和敏感度。T

4、aq DNA 聚合酶的发现使 PCR 得以广泛的应用6，Taq DNA 聚合酶现已可用基因重组的方法生产，但其制备效率仍有待提高。为此，笔者将 Taq DNA 聚合酶基因插入 6xHis 标记的 pET-32A 载体，并以 pET-32A/BL21( DE3) 为表达体系，利用 Taq DNA 聚合酶的耐热特性，以简单和低廉的热处理工艺，获得了可替代商品 Taq DNA 聚合酶的酶制剂。1 材料与方法1 1 材料 BL21( DE3) 实验室自备，表达载体 pET-32A 由其他实验室提供，用于 PCR 反应的 dNTPs、商品 Taq DNA 聚合酶及 DNA Marker 均购自宝生物工程

5、( 大连) 有限公司，质粒抽提与纯化试剂盒购于 OMEGA 公司，SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质购于北京科百奥生物技术有限公司。1 2 Taq DNA 聚合酶表达载体构建 利用引物( 5-GGGG-GAATTCCTGCCCCTCTTTGAGCCCAA-3，5 -GGGGGCGGC-CGCTCACTCCTTGGCGGAGAGCC-3) ，扩增出 2 493 bp 的片段，PCR 产物经过限制性内切酶 EcoR I 和 NotI 酶切后，连接到经过 EcoR I 和 NotI 酶切过的 pET-32A 载体上，将连接质粒转化入 E coli BL21( DE3) ，通过质粒筛选即获得生产重组

6、 Taq DNA 聚合酶的工程菌株。1 3 Taq DNA 聚合酶基因的诱导表达 取 1 个已转化的阳性单克隆，转接于氨苄青霉素浓度为 100 g/ml 的 5 ml LB液体培养基，37 、250 r/min 培养12 h 活化转化细胞。再取100 l 培养液，转接到氨苄青霉素浓度为 200 g /ml 的 100ml LB 液体培养基，37 、250 r /min 振荡培养 2 h ( OD600=0. 4) 后，加入 100 l IPTG( 1 mol /L) ，37 250 r /min 振荡培养 16 h，诱导 Taq DNA 聚合酶基因的表达。1 4 Taq DNA 聚合酶的提取与

7、纯化( 1) 将培养液转入 50 ml 离心管 4 ，8 000 r/min 离心20 min。( 2) 弃去上清液，加入 3 ml 缓冲液 ATris-HCl( pH 7 9)50 mmol /L、Dextrose 50 mmol /L、EDTA 1 mmol /L，用振荡器将沉淀完全悬浮于缓冲液 A 中。( 3) 完全悬浮后再加入 4 mg/ml 溶菌酶。( 4) 加入溶菌酶后置于室温中 15 20 min。( 5) 静置后在离心管中加入 3 ml 缓冲液 BTris-HCl( pH7 9 ) 50 mmol /L、KCl 50 mmol /L、EDTA 1 mmol /L、NP-400

8、5% 、Tween-20 0 5% 。( 6) 75 水浴 60 min。( 7) 4 、12 000 g 离心 10 min。( 8) 吸取上清液注入另一 50 ml 离心管中，加入 6 ml 含50% 甘油的保存缓冲液Tris-HCl( pH8 0) 50 mmol /L、NaCl100 mmol /L、EDTA 0 1 mmol /L、DTT 0 5 mmol /L、Triton-x1001% 。( 9) 在上面的离心管中加入 12 ml 含75%甘油的保存缓冲液。1 5 Taq DNA 聚合酶总活力的测定 将该试验制得的 TaqDNA 聚合酶与实验室的商品酶同时作 PCR 反应，比较自

9、制酶与商品酶的酶活力。( 1) 以质粒 pUC18-T 为模板( 分子量为 3 0 kb) ，采用的引 物 为: P1，5-GATAAACGACGGCCAGT-3; P2，5-CAG-GAAACAGCTATGAC-3。( 2) PCR 反应体系( 25 l) : dNTP 4 l，Mg2 +4 l，PCRBuffer 5 l，模板 DNA 1 l，引物 52 l，引物 32 l，Taq 酶适量，加无菌水补齐。( 3) PCR 参数: 95 预变性5 min;95 变性50 s，48 退火 50 s，72 延伸 2 min，35 个循环; 72 延伸 5 min。PCR 产物于 0 8% 的琼脂

10、糖凝胶进行电泳。2 结果与分析2 1 Taq DNA 聚合酶表达载体构建 PCR 以 T aquaticus基因组DNA 为模板，扩增出2 493 bp 的DNA 片段，经测序确证该片段为 Taq DNA 聚合酶基因。将该片段通过限制性内切酶 EcoR I 和 NotI 酶切后，连接到 EcoR I 和 NotI 酶切 pET-32A 载体( 图 1) 。2 2 Taq DNA 聚合酶基因在大肠杆菌中的表达 氨苄青霉素阳性克隆发酵后抽提质粒，经限制性内切酶EcoR I 和 NotI双切，用08%琼脂糖电泳检测，如图 2 所示 2 493 bp 的 Taq基因片段。重组质粒经双向测序确证为 Ta

11、q DNA 聚合酶的重组载体，测序结果如图3。2 3 Taq DNA 聚合酶的提取与纯化 TaqDNA 聚合酶在诱导表达过程中，IPTG 浓度和诱导时间是影响表达量的关键因素。在该试验的表达体系中，1 mmol/L 的 IPTG 诱导16 h，获得了较高表达量。重组 Taq DNA 聚合酶载体的阳性克隆，发酵后的裂解产物经75 水浴加热1 h 处理，能够明显去除杂蛋白( 图4) ，去除杂蛋白后，出现的蛋白分子量与已知TaqDNA 聚合酶的蛋白分子量( 94 kD) 相吻合( 图 4 泳道 1 所示) 。2 4 Taq DNA 聚合酶总活力的测定 以 0 3 l 5 U /l 的商品 Taq D

12、NA 聚合酶为对照，分别用该实验室热纯化法制备的 Taq DNA 聚合酶020、015、0 1、0 08、0 05、0 30 l 进行PCR 扩增( 图 5) 。试验结果经 Quantity one 3 0 软件分析，测得该实验室热纯化制备的酶相当于购买 Taq DNA 聚合酶活力的( 210 011) ( P 001，n =3) 倍。3 讨论由于 Taq DNA 聚合酶在 PCR 中的广泛应用，有关 TaqDNA 聚合酶的制备技术一直在不断地优化提高。为了提高该酶的特异性、表达量和酶活力，研究主要集中在酶基因本身、表达载体的构建、分离纯化方法等方面。对酶本身的研究主要是对酶基因进行一些修饰和

13、突变，如杜汉森等7对Taq DNA 聚合酶进行了 N 端的定点诱变缺失和 C 端的连续缺失处理，对 Taq DNA 聚合酶的活性区域进行了系统的定位并对一些位点进行突变，以进一步研究突变后的功能8 11。可以通过除去或增加 1 到几个碱基对基因进行修饰。在构建重组表达质粒载体时，可以选择强的启动子，也可以考虑添加 1 个增强子，使酶基因能高水平表达。Engelke 等10曾构建重组质粒 pTTQ18 并在大肠杆菌中表达重组 Taq DNA聚合酶，纯化步骤要通过热变性杂蛋白、聚乙烯亚胺( PEI)沉淀，再经 BioRex 70 离子交换层析获得重组 Taq DNA 聚合酶纯品，为了保证酶的纯度和

14、有更高的酶活力，可采用更简便、更有效的分离纯化方法。该试验主要是在含有 T7 强启动子的 PET 系统进行表达，经过一步 75 热变性得到了较纯的酶，其酶活力比同类商品酶高 1 倍左右。以该试验构建的表达体系，用热纯化法能够简单、经济地制备 Taq DNA 聚合酶，以满足大量常规 PCR 扩增需求。4 结论将 Taq DNA 聚合酶插入带有 6xHis 标记的载体 pET-32A 能够通过 Ni 柱纯化获得高纯 Taq DNA 聚合酶。由于Taq DNA 聚合酶具有高耐热的特性，在 pET-32A / E coliBL21( DE3) 的表达体系中，75 水浴 1 h 即可有效地去除杂蛋白，制

15、备 Taq DNA 聚合酶比商品 Taq DNA 聚合酶的酶活性高1 倍。PCR 扩增试验结果显示，所制得的酶能够替代购买的 Taq DNA 聚合酶。该方法简单、经济，能够满足一般PCR 试验的要求。同时，6xHis 标记也为 Ni 柱纯化高纯度的聚合酶奠定了基础。参考文献1BROCK T D The value of basic research: discovery of Thermus aquaticusand other extreme thermophilesJ Genetics，1997，146( 4) : 1207 12102SAIKI R K，GELFAND D H，STOFT

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