大鼠原位肝移植模型的手术技巧

1、大鼠原位肝移植模型的手术技巧                 作者：王振猛，唐乙，宋少华，陆智杰，王全兴，俞卫锋【摘要】  目的 探讨建立稳定的大鼠原位肝移植模型的外科手术技巧，为研究肝脏缺血再灌注损伤提供技术支持。方法 110只雄性SD大鼠随机配对后分别作为供体和受体，通过改良Kamada“二袖套”法施行大鼠原位肝移植。结果 改良Kamada法建立大鼠原位肝移植模型共52例，7d 生存率88.5%，7例长期存活大于100 d

2、。 结论 大鼠原位肝移植模型的建立需要极度的耐心和娴熟的手术技巧，模型的建立有助于研究肝脏缺血再灌注损伤，移植免疫及器官保存。 【关键词】  原位肝移植；动物模型；大鼠   Abstract： Objective  To improve the operation technique for orthotopic liver transplantation in rats, and illustrate the hepatic ischemia-reperfusion injury in future study.Methods  One hu

3、ndred and ten male SD rat were randomly paired as donor and receptor and were performed with orthotopic liver transplantation by modified Kamadas two cuffs technique.Results  As a result, 88.5% of the 52 rats with orthotopic liver transplantation survived more than 7 days and 7 ones survived lo

4、nger than 100 days. Conclusion  Extreme patience and skillful surgical techniques are necessary for rat orthotopic liver transplantation model, which is helpful to the study on hepatic ischemia-reperfusion injury, transplantation immunity and organ preservation.   Key  words： ort

5、hotopic liver transplantation; animal model; rat   Starzl于1963年首先为一先天性胆道闭锁的儿童施行肝脏移植手术后，肝移植术已逐渐成为各种急慢性肝功能衰竭的有效的治疗手段，但肝脏缺血再灌注损伤仍不可避免，并已成为移植肝功能不佳或原发性无功能的主要原因，在术后1周内需再次行肝移植的患者中移植肝无功能约占81%1。   大鼠肝脏移植模型是研究肝脏缺血再灌注损伤、移植免疫、器官保存等基础理论的理想模型，对于进一步探讨围术期肝脏缺血再灌注损伤具有重要的意义。目前国内关于大鼠肝移植模型建立的文章已比较多，本

6、文主要从手术细节方面具体讨论手术技巧和需要注意的问题。   1  材料与方法    1.1  材料  供受体均采用封闭群SD雄性大鼠，购自第二军医大学实验动物中心，重200250 g，实验室清洁级饲养，随机配对后以体重较轻者为供体。门静脉袖套采用内径2.2 mm，外径2.6 mm的套管鞘，袖套长约3 mm，下腔静脉袖套使用内径3.0 mm，外径3.6 mm 的聚乙烯奶品吸管，袖套长3 mm，袖套均留2 mm 柄部供夹持，以刻槽器在管壁上刻槽以防止打结时丝线滑脱。胆总管套管应用外径1 mm 的一次性硬膜外麻醉导管，长

7、6 mm，两端修剪成斜面。显微器械购自上海手术器械厂。结扎线用50普通丝线，血管缝合线用70号丝线，均购自上海金环医疗用品厂。灌注及保存液均为4 乳酸钠林格液，其中每ml灌注液中含肝素25 U，地塞米松20 g；肝素化液为4 生理盐水，每ml含肝素50 U。   1.2  手术方法   1.2.1  供体  按照改良Kamada法2行大鼠原位肝移植术。乙醚吸入麻醉成功后，腹腔内迅速注射苯巴比妥（50 mg/kg），大鼠取仰卧位，腹部大十字切口，剑突牵引，置腰垫，将肠袢移至腹腔外左侧，覆盖湿纱布，远离肝脏剪断肝镰状韧带、冠状韧

8、带，游离并双结扎离断左膈下静脉。游离肝盘状乳头突表面韧带以充分暴露盘状乳头突。双结扎离断食管静脉，离断肝胃韧带，游离肝动脉并挂线待灌注后打结。分离胆道，距离左右肝管汇合部1.5 cm 处插管，结扎后远端剪断，留牵引线一根备用。暴露幽门静脉并挂线待灌注后打结。剪开肝尾状叶的韧带和下腔静脉以及肾静脉表面的后腹膜及结缔组织膜，暴露肾静脉并双重结扎离断。将左肾静脉至肝尾叶之间的下腔静脉完全游离，肝尾状叶后部穿线结扎右肾上腺静脉，然后剪开右侧肝食管韧带。暴露右腰静脉，注入4 肝素生理盐水2 ml，棉球按压止血；将后腹膜分离至腹主动脉分叉处，约肝素化后2 min 由腹主动脉分叉处穿刺置入套管针。剪开膈肌，

9、夹闭胸主动脉，剪开心脏及下腔静脉胸内段，在套管针穿刺点以下剪开下腔静脉，匀速注入4 灌注液20 ml，同时在供肝表面缓慢浇冰水保持低温。依次结扎并离断肝动脉和幽门静脉。钝性游离门静脉，并在脾静脉水平以喇叭形切口离断。剪断膈肌，稍微提起肝脏钝性游离下腔静脉在左肾静脉水平以喇叭形切口离断。以林格液保存在不锈钢碗并置入4 冰箱中。   1.2.2  修肝  将不锈钢碗放在自置冰槽中，修剪肝下下腔静脉，剔除多余结缔组织后套入袖套，然后同法处理门静脉，将套管针置入门静脉袖套处，注入4 林格液10 ml，进一步冲洗肝脏并观察是否有冲洗液由肝上及肝下下腔静脉流出。沿肝

10、上下腔静脉内壁剪除胸内段下腔静脉，然后将肝上下腔静脉前壁的肌肉全部剪掉，后壁则保留部分膈肌。左侧穿一较长血管缝合线供缝合，右侧穿一短血管缝合线供牵引。供肝保存于4 。   1.2.3  受体  受体术前应禁食810 h，麻醉前10 min 肌注阿托品0.03 mg，乙醚持续吸入维持麻醉。取腹部纵切口，胸骨柄根部结扎并牵拉以利于暴露，以自制“U”型拉钩牵引双侧肋弓。彻底止血，肠袢移至腹腔左侧，以温盐水纱布包裹。基本处理同供体，不同点在于直接结扎并离断肝动脉，不处理幽门静脉及右肾静脉，右肾上腺静脉结扎后不离断。左右肝管分支结扎后近肝侧剪断，并留置牵引线。检查

11、所需用具后，血管夹夹闭门静脉，进入无肝期计时，近肝侧门静脉分支内注入2 ml 室温林格液将肝内血管床残留血液驱回体循环，血管夹夹闭肝下下腔静脉。由左侧膈下向右置入沙氏钳，连同部分膈肌一起钳夹，注意不要钳夹肺组织并观察大鼠呼吸及心跳情况。贴近肝表面剪断肝上下腔静脉，近肝侧剪断门静脉，剪断肝下下腔静脉，同时保留少量汇入部的肝尾状叶。供肝原位置入，先缝合左右两侧血管壁，然后从肝上下腔静脉左侧后壁水平连续外翻缝合，前壁也采用连续外翻缝合，吻合结束前肝上下腔静脉内注入少量室温保存液，将肝内气泡排出。将供肝翻向头侧，以直血管钳夹紧门静脉，尽量靠近断端，稍微向尾侧松门静脉血管夹，剪刀贴近血管钳剪开受体门静脉

12、前壁，在门静脉背侧预留丝线结扎，弯血管钳夹住袖套柄，室温保存液冲洗受体及供肝门静脉内壁，排出气泡后将供肝门静脉袖套置入受体门静脉内。以预留线双重结扎，开放门静脉血流。释放沙氏钳，无肝期结束计时。同法将下腔静脉袖套置入受体内，开放下腔静脉。受体胆总管以预留的两根牵引线固定稳妥后，剪开受体左右胆管汇合部，将供肝胆总管套管插入受体胆总管内，丝线结扎并与供肝预留的胆道丝线结扎。检查腹腔有无出血并以棉球吸尽腹腔内液体，肠袢还纳腹腔内，腹壁逐层缝合。            2  结果 &

13、#160; 术后从苏醒翻身开始计时，存活超过24 h视为手术成功3。供体手术时间3039 min，供肝准备时间1321 min，受体手术时间4766 min，受体无肝期时间1726 min，7 d 生存率88.5%(46/52) ，最长存活的7例超过100 d。2例失败于门静脉袖套滑脱出血(2例)，空气栓塞(2例)，肝上下腔吻合口出血（1例），胆漏(1例)。远期死于供肝慢性失功能、腹腔感染、肺部感染和营养不良。   3  讨论   3.1  麻醉  供体以腹腔内注射苯巴比妥（50 mg/kg）为首选，该法不会染污空气且不对术

14、者造成影响。受体仍以乙醚持续吸入麻醉为最佳， 其浓度可控制，在无肝期容易终止，同时乙醚诱导快，苏醒快，对大鼠术后恢复有利4。但乙醚会增加呼吸道分泌物，受体术前应当肌注阿托品，围术期可将大鼠舌拉出减少通气障碍。在受体无肝期内， 因为缺少肝脏代谢，麻醉深度难以控制，应撤去乙醚。初学者经常因专心手术而忘记麻醉深度致大鼠呼吸心跳停止，因此应密切注意大鼠呼吸情况，如有呼吸频率减慢，应暂停手术操作并停止麻醉，待呼吸平稳后再继续麻醉和手术。一般而言，呼吸停止后的复苏常难以奏效。   3.2  肝脏灌注  腹主动脉穿刺置管后要防止血液倒流入注射器内，胸主动脉钳夹要确实，

15、剪开胸内段下腔静脉时应避免损伤胸主动脉，然后可开始灌注，在腹主动脉穿刺点以下剪开肝下下腔静脉，注意防止损伤腹主动脉影响灌注效果。灌注要缓慢均匀，速度不宜过快，约维持在23 ml/min，灌注过快易于引起肝细胞水肿，灌注过慢则会引起灌注不足。经腹主动脉灌注1 min 即可发现肝脏颜色变淡，否则应及时予门静脉灌注。灌注时应间断的将0 冰水浇在肝脏表面，灌注满意的肝脏无水肿并保持原有质感，呈土黄色，肝叶边缘锐利。   3.3  修肝  根据供肝门静脉直径选择相应大小的门静脉袖套，口径不能太小，以刻槽器在管壁上刻槽以便丝线结扎时不易滑脱。清除供肝门静脉周围脂肪结

16、缔组织，幽门静脉应紧靠门静脉结扎离断，留结尽量小，以免大团线结残留袖套内影响套管操作和门脉血流通畅。套管时将袖套柄对准胆管以确保受体套管时柄部向上，便于夹持，结扎时应保证丝线在套管的槽内，防止滑落。对于下腔静脉，要求基本同门静脉，套管时将袖套柄对准尾状叶的切状缘。修剪肝上下腔静脉时，先将下腔静脉周围全部展开并充分暴露，观察血管壁的边界。然后提起肝上下腔静脉胸内段与膈肌平面成一定角度，于腔静脉壁与膈肌环交界处剪一小口作为突破口沿上腔静脉壁和膈肌环交界处将肝上下腔静脉胸内段全部修剪掉。沿膈肌环将前壁剩余膈肌组织修剪掉，后壁则保留部分膈肌。缝牵引线时应保证前壁比后壁略多一些，以便于缝合。 

17、  3.4  下肝  采用由左侧经膈下向右侧放置的方式置入沙氏钳，钳夹时应避免夹住肺组织，并注意观察呼吸情况，如发现呼吸减慢，则先放松后再慢慢夹住，然后以橡皮泥自制凹槽在大鼠左侧固定钳柄，尽力使钳子头部上撬便于显露下腔静脉后壁。离断肝上下腔静脉时应使剪刀尽量贴近肝脏并注意保护左膈下静脉的线结，离断门静脉时同时使剪刀尽量贴近肝脏以保留尽可能多的门静脉，离断肝下下腔静脉则应将剪刀略微上挑，避免损伤周围组织及血管，同时保留少量汇入部的肝尾叶以便于套管。   3.5  下腔静脉的吻合  下腔静脉的吻合是手术成功的关键，要求吻合速度快

18、，吻合口不漏血漏气且无狭窄。早期训练时要先确保缝合的效果，要求针距基本相等，缝合组织不宜过多或过少，无出血及狭窄，待熟练后再要求速度。一定要辨认清楚下腔静脉的前后壁层次，尤其是吻合接近完毕时前后壁贴近不易辨认，容易出现前后壁缝合为一层而造成吻合口狭窄。出针要沿缝针弧度，不可扯拉以免撕裂血管，每缝完一针后均要求排线。先缝合右侧牵引线再缝合左侧，然后将针从右侧牵引处由血管外原位进入血管内，第一针应紧靠牵引处，再由左向右缝合后壁，后壁缝合结束后从右侧牵引处由血管内原位进入血管外，由右向左缝合前壁，应注意观察供受体前壁的长度，根据吻合口的不同大小调整针距，一般而言易出现供体前壁比受体要长。早期手术时易

19、出现无肝期结束后大鼠呼吸减慢，肝脏颜色变暗的情况，其原因为气体栓塞，因此必须充分排气。首先前壁缝合1或2针后由肝上下腔静脉由供肝内打水，同时以湿棉签轻轻按压供肝；在吻合最后2或3针前，应保证供受体未吻合的下腔静脉前壁长度基本一致，助手再次向供肝内打水排气，然后牵引左侧尾线，避免气体进入。   3.6  袖套置入技术  门静脉袖套置入非常关键，关键到无肝期的时间。早期操作常感到受体门静脉过短，袖套置入困难，反复操作致门脉撕裂直至没有足够长度的门静脉可供套入，最后彻底失败，还会出现结扎线从套管处滑脱引起出血或狭窄，供体的门静脉扭转致血流不畅等情况。因此门静脉

20、套管时首先要尽量靠离断处夹住血管，将血管夹略微松开并向下一些重新夹住使门静脉充盈，然后紧贴血管钳剪开门静脉前壁并冲洗，于供肝门静脉背侧预留丝线结扎，助手以直血管钳夹紧供肝门静脉，以弯血管钳夹住受体门静脉套管柄，术者将套管针由门静脉袖套置入供肝内并打水至袖套由水流出以进一步排清供肝内气体，然后术者暴露门脉后置入袖套，最后当术者打紧第一个结后，助手放开血管钳再打第二个结。结扎时要求双线结扎，第一根线结扎在供体套管线结的尾侧，第二根线结扎在头侧，以免线结在受体血管内引起血栓。同时还要注意袖套不要插入过深以免影响幽门静脉回流。下肝时保留少量受体汇入部的肝尾叶，右肾上腺血管丛结扎后不要剪断，可作为固定支

21、撑点，使受体下腔静脉充分张开，套管前应向受体下腔静脉内打水排气以防止气栓。套管后应以棉球吸干腹腔内液体，检查下腔静脉周围有无出血，有时会出现肝下下腔静脉出血，可能由于汇入下腔静脉的分支引起的，应在袖套头侧结扎。其他注意事项同门静脉套管。   3.7  其他方面  手术时可考虑在背部垫一2 cm 高的腰垫，并随操作的部位而相应调整以达到最佳的暴露效果。操作应小心细致，动作轻柔，镊子剪刀等尖锐器械不可触及供肝表面。肝脏质地脆弱，棉签按压时间过长，压力过大，都会出现肝挫伤淤血导致微血栓形成，影响灌注质量，手术时应遵循一定的操作顺序，避免反复翻动肝脏，建议按照顺时针的顺序依次处理。大鼠术中出血量应0.5 ml，2 ml 多于24 h 内死亡5。术前禁食保证胃部空虚利于操作，但时间不可过长，禁食时间最好控制在810 h。受体手术过程中应注意保温，冲洗套管时最好用37 林格液，关腹后经*背静脉补液12 ml 以补充术中液体丢失量。为便于手术操作可自制一些简易工具，如“U”型拉钩有助于暴露受体术野，橡皮泥自制凹槽可用于固定沙氏钳并利于肝上上腔