外源性降钙素基因相关肽改善体外循环再灌注后冠状微循环的研究

1、    外源性降钙素基因相关肽 改善体外循环再灌注后冠状微循环的研究        【摘要】目的 研究体外循环全心缺血再灌注损伤时冠状微循环的动态变化以及外源性降钙素基因相关肽 （CGRP）的心肌保护作用。 方法 建立猪体外循环心肌缺血再灌注模型，分别于心肌再灌注前后不同时间点观测心肌微区灌 流量、微血管形态和微血流动态的变化；并以外源性CGRP作为心肌麻痹液的组成部分，观测 其对冠状微循环的影响。 结果心肌再灌注后表现为明显的冠状微循环障碍，应用CGRP组在再灌注

2、后各时间点的心肌微区灌 流量、微血管形态和微血流动态均较对照组明显改善，心功能亦显著改善。 结论体外循环心肌再灌注后出现了冠状微循环障碍，外源性CGRP作为心肌麻痹液的组成部分可改 善体外循环心肌再灌注后心脏的微循环功能，从而起到心肌保护作用。【关键词】降钙素基因相关肽；体外循环；微循环 Exogenous CGRP to improve coronary microcirculation after myocardial reperfusion during cardiopulmonary bypassLI Xin, CHEN Zhanggen, JIA Bing, et al.(Cardi

3、ovascular Center, Children's Hospit al, Fu Dan University Medical Center, Shanghai 200032， China)【Abstract】Objective To observe the changes of myocardial microcirculation after ischemia-reperfusion during cardiopulmonary bypass (CPB) and the effects of exogenous calcitonin gen e-related peptide

4、(CGRP) on myocardial protection. MethodsIn vivo porcine models, 10 controls and 10 CGRP used animals (CGRP group) wer e performed on median sternotomy followed by a standard CPB. All the hearts were arrested for 45 minutes. In the CGRP group, 1g/kg CGRP was added into the c ardioplegia, and reperfus

5、ed into the aortic root before the removal of aortic cl amp seperately. In both groups, myocardial microvascular perfusion, corona ry arterial microvessel diameter and microvessel blood flow on the right atrium were detected by a laser doppler flowmeter and a contact microscope with TV mon itor on f

6、ive consecutive point of time ( before aortic clamping, 5, 30, 60 and 1 20 minutes after reperfusion). ResultsThe myocardial microvascular perfusion was markedly decreased and coronary arter ial microvessels became much thinner and pulsatile flow appeared when the heart was reperfused. It indicated

7、the dysfunction of the coronary microcirculation. M yocardial microvascular perfusion was significantly higher and coronary arterial microvessel diameter was larger in the CGRP group on each point of time of repe rfusion compared to those in the control group. In the CGRP group, microvessel b lood f

8、low also improved significantly than that in the control group during repe rfusion. ConclusionsMyocardial microcirculation disorders exist in cardiac ischemia-reperfusion dur ing CPB. As a component of cardioplegia, CGRP improves the myocardial microcircu lation and could become a new, potent myocar

9、dial protector.【Key words】Calcitonin gene-related peptide；Extracorporeal circulation；Microcirculation降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）是人体内一种强大的舒血 管神经多肽。研究表明，CGRP可显著改善实验性心肌梗塞后的心功能障碍1，但 是至今尚未见关于CGRP对减轻体外循环心脏直视手术导致的全心缺血-再灌注损伤的研究 。本实验通过建立猪体外循环心肌缺血-再灌注模型，应用激光多普勒微循环血流计和接触 式显微镜观测CGRP作为心肌麻痹液的组

10、成部分，对体外循环心肌再灌注后冠状微循环变化的 影响，探讨其对体外循环心肌保护作用的机制。材料与方法一、 动物模型的建立实验用小型猪20头，分为用药组（CGRP组）和对照组各10头，体重2025kg，雌雄不拘。 5（质量百分数）戊巴比妥钠4060mg/kg腹腔麻醉（手术期间以1（质量百分数）戊 巴比妥钠静脉间歇给药），气管切开并插管，接呼吸机通气；建立静脉输液通路，颈动脉插 管监测外周血压，同时监测心电，记录心率。胸部正中切口开胸，暴露心脏，心尖部插管 监测左心室压力。取右心耳三点（边长1cm的等边三角形）缝线固定，其间的区域作为微循 环观测窗。分别作主动脉和上、下腔静脉插管，建立标准体外循环

11、。体外循环采用SARNS 70 00型体外循环机、复旦-16膜式氧合器。体外循环开始后逐步降温，10min后阻断升主动 脉，同时主动脉根部灌注4晶体心肌麻痹液（改良St.Thomas液）15ml/kg（用药 组含有CGRP 0.5g/kg），使心脏松弛停跳。维持直肠温度2528。阻断30mi n开始复温，阻断45min后开放升主动脉阻断钳（用药组于开放前再次灌注CGRP 0.5 g/kg），使心脏复跳。120min后处死动物。CGRP由Peninsula公司提供，500g/瓶，干粉剂。二、观测方法和统计学处理分别于体外循环开始10min（即心脏停跳前）、主动脉开放后5min、30min、60m

12、in 和120min等5个时间点，用接触式显微镜（徐州豪立电子有限公司生产，型号SX-01 ）在放大40倍的情况下于电视监测器屏幕上观测体外循环心脏缺血-再灌注前后右心耳表面 冠状微血管形态和微血流的动态变化，对血管管径在电视电脑定量测定仪上作定量测定（浙 江大学细胞像定量测定软件包），对血流变化作定性形态描述。应用激光多普勒微循环血 流计（天津南开大学电子仪器厂生产，型号LDF-2）测定心肌微区灌流量，激光探头直径1 mm，测定的灌流量数值用电压（单位：V）表示，增益30。同时记录心率（HR）和外周动 脉收缩压（BP）、左室收缩末压（LVESP）和舒张末压（LVEDP）。定量结果资料以均数&

13、#177;标准差（±s）表示，应用SAS统计软件，采用配对t 检验作统计学显著性分析。结果见表1。1.心肌微区灌流量体外循环心脏再灌注后心肌微区灌流量明显下降，再灌注5min和30 min与转流前相比，P<0.01和P<0.05。再灌注60min后渐恢复至正常水平 。CGRP组在心脏再灌注5min、30min、60min和120min时，心肌微区灌流量均显 著高于对照组（P值均<0.01）。2.微血管形态体外循环前观察到，正常猪心表面冠状微动脉管径在3560m之间，由 微动脉分支形成的下游微血管呈网状。在对照组中，再灌注后5min、30min和60min时 冠状微动

14、脉管径显著缩小（P值均<0.01），再灌注120min时仍较缺血前缩小，但 无统计学差别。CGRP组在心肌再灌注5min时与再灌注前相比，冠状微动脉管径明显缩小（ P<0.01），但有1/2的心脏表面微血管仅有轻度痉挛。30min开始恢复，此时微动 脉管径平均为缺血再灌注前的75%，与缺血再灌注前相比管径仍有明显缩小（P<0.05 ）。60min时微血管痉挛完全恢复，并转为明显扩张，冠状微动脉管径扩大到缺血前的1 25%，与缺血再灌注前相比管径明显扩张（P<0.05）。120min时，冠状微血管仍 然扩张，但并未继续扩大，与缺血再灌注前相比差别不明显（P>0.05

15、）。CGRP组冠 状微动脉管径在缺血再灌注后30min、60min和120min时均较对照组明显扩张（P< 0.01）。3.微血流动态在对照组中，再灌注后各时间点微血管中出现搏动性血流，血流呈明显颗 粒状，有血浆与血细胞分离现象，提示有明显的红细胞聚集与毛细血管前括约肌痉挛。随再 灌注时间延长，上述现象仅有轻微改善，再灌注120min时，微血流仍呈粒状，但流速基本 均匀、稳定。CGRP组仅再灌注5min微血流呈颗粒状，但流速基本均匀、稳定；再灌注 30min时，冠状微动脉血流呈线状、流畅；再灌注60min时，已无明显红细胞聚集现象； 再灌注120min时，冠状微动脉中的微血流继续保持线状

16、，流速快。4.血流动力学指标心脏再灌注早期，心率增快并逐渐减慢。CGRP组在心脏再灌注30min 、60min和120min时，心率均慢于对照组（P均<0.05）。外周血压在再灌 注早期呈较低水平，并逐渐升高。CGRP组在心脏再灌注30min和60min时，外周血压均高 于对照组（P均<0.01）。体外循环心脏再灌注后早期，LVESP较体外循环前显著下 降，LVEDP显著上升。CGRP组在心脏再灌注5min、30min和60min时，LVESP均高于 对照组（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。LVEDP在心肌再灌注5mi n、30min、60min和12

17、0min均低于对照组（P<0.01，P<0.01，P <0.01，P<0.05）。表1两组体外循环围术期冠状微动脉管径、 心肌微区灌流量、血流动力学的变化(±s)项目组别停跳前开放5min开放30min开放60min开 放120min心肌微区灌流量(V)对照组371.0±60.7212.0±83.4*290.0±5 8.3*397.0±49.9413.0±40.6CGRP组410.0±51.4360.0±72.6*461.0 ±56.7504.0±32.0499.0

18、77;32.1 微动脉管径(m)对照组50.0±2.522.0±3.3*22.5±2.5*23.8±1.3*42.5±7.5CGRP组48.8±12.820.0±9.3*37.5±9.0*61.8±21.0*55.0±12.8 HR(次/min)对照组117.3±11.7149.4±22.0*143.6±19.7*134.3±13.4*125.5±13.1CGRP组115.0±13.5134.9±23.4*125.5±

19、;7.8*118.0±10.4115.5±11.9BP(mmHg)对照组83.6±14.034.3±7.3*61.6±7.5*70.4±9.2*88.4±10.0CGRP组83.4±18.235.4±7.9*81.1±10.6*90.8±10.591.3±6.2LVESP(mmHg)对照组85.7±13.643.6±7.2*62.6±5.9*71.9±8.2*56.2±6.3CGRP组90.0±17.852.2

20、77;6.6*82.7±8.4*92.2±10.058.7±6.7LVEDP(mmHg)对照组1.0±1.513.1±4.0*12.2±4.1*9.1±3.9*3.1±2.3CGRP组0.7±1.55.0±2.3*1.3±2.10.5±2.10.4±1.6体外循环各时间点与心脏停跳前相比：*P<0.05，*P<0.01；CGRP组与对照组相比：P<0.05，P<0.01 讨论体外循环心脏直视手术中，由于主动脉阻断和开放导致心肌缺血再灌注损伤，

21、术后出现心 肌收缩力减弱（心肌顿抑）、心律失常、冠状血管微循环障碍甚至心肌细胞坏死等，临床上 可出现泵功能衰竭。因此心肌保护始终是心脏外科的一大课题。近10年来，国内外对心 肌缺血-再灌注损伤进行了大量研究，但其发生机制尚未完全明了。目前认为其原因与钙离 子超负荷及氧自由基有直接关系。然而，在心肌再灌注时，冠状循环也发生了重大的变化， 尤其是直接参与组织细胞物质交换的微循环病理生理改变尤为突出2，微循环障 碍直接参与了心肌再灌注损伤。在显微镜下进行微循环活体观察，能及时了解微循环的动态变化，其主要观察指标是微血管 形态和微血流动态3。传统的方法是应用固定的带透射光源的显微镜，作固定器 官、组织

22、如肠系膜、软脑膜等微循环的观测，而对活动的心脏进行微循环观测是比较困难的 。带内光源的接触式显微镜，其镜头体积小、轻巧灵活，通过与相对固定的心脏表面轻微接 触，能观察到活体心脏心外膜的微血管形态和微血流流态；通过与电视摄像系统连接，可获 得满意的像，并应用标准物镜测微器和像分析得出可靠的数据。自从1972年Riva首先使用激光多普勒技术测定兔视网膜动脉血流速度以来，激光多普勒技术 在微循环研究中得到了广泛的应用。应用激光多普勒微循环血流计测得的Doppler计数可反 映激光探头照射局部半径1mm的半球体内的微血管血液相对灌流量4。以往有报 道用于固定器官如胃粘膜、肾、肝、脾、小肠、转移皮瓣等血

23、流量的测定。本实验中选取右 心耳三点固定的方法作心肌微循环的观测，可以在心脏跳动时仍能比较稳定地测得Doppler 计数和获得满意的微血管像。结果显示，体外循环心肌再灌注时心肌微循环发生了显著的 改变，其变化与围术期心功能的恢复过程有一定的相关性。CGRP是1983年Rosenfeld等应用基因重组技术发现的一种含有37个氨基酸残基的神经多肽 5，它是迄今为止已知的人体内最强的舒血管物质，含CGRP的神经纤维广泛分布于 心血管系统，其特异性受体除中枢、外周神经系统外，遍布心脏所有区域，主要是冠状血管 ，而且以小冠脉分布显著6。研究表明，CGRP对冠状动脉有强大的扩张作用，其 作用比硝酸甘油、硝

24、普钠强240倍，亦远强于P物质、心钠素、血管活性肠肽、异丙肾上腺素 、组胺等。已有大量实验证明，外源性CGRP可明显促进心肌缺血-再灌注损伤时的心功能恢复，减轻损 伤程度。其作用机制与CGRP对心肌的正性变力、变时，以及降低脂质过氧化物产生有关 7。本实验观察到， CGRP组心肌微循环灌流量、冠状微血管管径、微血流动态在心脏 再灌注后各时间点均较对照组显著改善。CGRP组在再灌注30min时心脏收缩有力，血压稳 定，已能脱离体外循环。值得注意的是，由于激光多普勒微循环血流计测得的心肌微循环灌 流量与微血管内的血流速度成正比4，因此其测定值与心率、血压亦呈正相关。 本实验通过同时监测心率和血压发

25、现，心脏再灌注后心率由增快至逐渐减慢，血压在再灌注 5min时与对照组无显著差别，在后几个时间点高于对照组，证明了应用CGRP后心肌微循环 的改善并非是心率变化后的继发性改变，且微循环的改善早于血压的升高。由此可见，CGRP 可能通过其强大的扩张冠状动脉的作用改善体外循环心肌再灌注后心脏的微循环功能，从而 达到减轻再灌注损伤和起到心肌保护的作用。本实验在传统心肌保护，即在心脏阻断时于主动脉根部灌注4心肌麻痹液（St.Thomas液 ）的基础上加入CGRP，并在主动脉开放前复灌一次，目的是使心肌缺血期间和再灌注早期冠 状血管内维持较高浓度的CGRP，从而更好地发挥其作用，操作亦简便易行。CGRP作为心血管 系统的一种重要的调节多肽，目前已可通过基因工程表达或全化学合成而得到，有希望成为 一种新的、强效的心肌保护剂。作者单位：李?(200032上海，复旦大学医学院附属儿科医院心血管中心)陈张根(200032上海，复旦大学医学院附属儿科医院心血管中心)贾兵(200032上海，复旦大学医学院附属儿科医院心血管中心