十二指肠液K-ras癌基因检测在胆管癌早期诊断中的应用价值

1、十二指肠液K-ras癌基因检测在胆管癌早期诊断中的应用价值     【摘要】  目的 探讨十二指肠液标本中K-ras癌基因检测对胆管癌早期诊断的价值。方法 应用DNAzolR 试剂提取DNA，通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorplism，PCR-RFLP）法分析，检测30例胆管癌患者和10例良性胆道疾病患者胆汁及十二指肠液标本中上清液及沉渣的K-ras基因突变情况。结果 胆管癌组胆汁标本的上清液中K-ras基因突变检测

2、的阳性率为56.7%；相应的十二指肠液标本阳性率为43%。良性胆道疾病组仅胆汁标本检出K-ras基因突变1例，良恶性疾病组比较差异有统计学意义P<0.005），胆管癌K-ras基因突变的检出率在上清液组中明显高于沉渣组，两者比较差异有统计学意义P<0.005），对于胆管刷检阴性的胆管癌患者，检测胆汁中K-ras基因突变的阳性率仍可达39.3%。结论 应用DNAzolR 试剂能有效提取到胆汁及十二指肠液标本中的DNA，十二指肠液K-ras基因检测可能有助于胆管癌的早期诊断。 【关键词】  胆管肿瘤 K-ras基因 十二指肠液    &

3、#160;   Abstact   Objecive  To explore the applied value of detection of K-ras gene mutations in the duodenal juice of patients with biliary tract carcinoma (BTCa) in early diagnosis. Methods  DNA was extracted using DNAzolR reagent. The situation of K-ras mutation in t

4、he supernant and sediments in the sample of bile and duodenal in 30 cases with BTCa and 10 cases with benign choledocholithiasis were detected with PCR-RFLP. Results  The positive rates of assay with K-ras gene mutations in bile supernatant of patients with BTCa were 56.7%. Accordingly， the pos

5、itive rates of those in duodenal juice were 43%. Only one case K-ras gene mutation was detected in benign choledochlithiasis. Statistic analysis showed there was significant difference in those gene mutation between BTCa group and benign group(P<0.005). Positive rate of K-ras gene mutations was h

6、igher in the supernatant than that in the sediments  (P<0.005). For the negative of bile duct brushing in BTCa, positive rates of assay with K-ras gene mutation could still reach 39.3%. Conclusions  DNA can be extracted from bile and duodenal juice with DNAzolR reagent. Assay with K-ras

7、 gene mutations in duodenal juice may be useful for early diagnosis of biliary tract carcinoma.    Key words   biliary tract neoplasms； K-ras gene； duodenal juice 胆管癌系高度恶性肿瘤，以往认为其发病率低，近年来随着现代医学诊疗技术的发展，胆管癌的发病率也不断上升，同时对此病的诊治也不断取得进展，但由于胆管癌的解剖部位隐匿，早期诊断仍非常困难，一旦发现多为晚期，致使手术切除率低，预后差

8、。发展新的筛选和诊断手段，是提高胆管癌早期诊断率和改善胆管癌预后的关键。    我们采用分子生物学技术，对胆管癌患者的胆汁和十二指肠液中的癌基因K-ras的突变进行检测，探讨这种检查方法在胆管癌的早期诊断或在胆管癌筛查中的应用价值。    1  对象和方法    11  对象  本课题实验研究对象均为2004年02月至2005年02月间在本院的住院患者，其中包括：胆管癌组共30例，男/女为19/11，年龄为3089岁，平均年龄为（62±14）岁。其他良性胆道疾病组（

9、对照组）共10例，男/女为6/4，年龄为2878岁，平均年龄为（54±15）岁，均为胆结石患者。上述病例的诊断均经细胞学检查或手术探查证实。胆管癌组的病例中，按照Bismuth分型，型13例，型7例，A2例，B3例，型5例。    12  方法    121  标本的来源  所有病例的十二指肠液标本均通过十二指肠引流管获取。胆管癌组的胆汁标本通过逆行胰胆管造影术（endoscopic retrograde cholangio-pancreatography， ERCP)胆管插管后抽取，良性胆道疾

10、病对照组的胆汁标本均通过术后T管引流处获取。    所有标本获取后迅速在常温下2000 r/min离心20 min，分成上清液和沉渣两部分，并即时冻存于-80以备DNA提取。    胆管癌组的患者，在ERCP时，同时行胆道刷检术，作细胞学检查。    122  标本的DNA提取  从-80取出标本，室温下溶解后，取1 ml标本，按DNAzolR reagent(Cat.No:10503-027,CAS.No:593-84-0; Invitrogen TM,US)的说明书步骤提取DNA：

11、标本的溶解匀化：培养血细胞（约1×107细胞）+1 mlDNAzolR摇匀。标本的离心：室温下离心（10 000 g、10 min）后，将上清液移至新试管。DNA的收集：上清溶解液中加入0.5 ml 100%乙醇每1 ml DNAzol，上下颠倒混匀，室温下静置3 min，再离心（4 000 g、12 min）后，静置1 min，然后吸去管内液体。DNA的洗涤：于试管中加入1 ml 75%乙醇，上下颠倒混匀36次后，静置1 min，吸去乙醇，此步骤至少重复两次后，让标本在空气中自然干燥。DNA的溶解：于试管中缓慢加入100 ?滋l 8 mM NaOH 溶解DNA，然后在4 -20 下

12、贮存备用。    123  引物设计  所有引物的设计由本院分子生物实验室，根据Pubmed的Genome数据库，自行设计提供。引物合成是委托上海生物工程公司合成。    124  K-ras基因第12密码突变的检测  采用突变富集聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法，可以检测出第一外显子第12密码子的突变。引物序列KR-F：5ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3；KR31-R：5TCAAAGAATGGTCCTGGACC3；KR32-R：5TGCACCAGTAATATGCATAT3。    经2次PCR及2次酶切反应，酶切产物行3%琼脂糖凝胶电泳，凡出现143bp的突变带者，都认为是有K-ras基因第12突变，否则认为其是野生型。实验过程中以灭菌去离子水为PCR反应模板作阴性对照；每份标本至少重复实验两次。    13  统计学方法  两