垂体腺苷酸环化酶激活肽对大鼠脑缺血再灌注后诱导性一氧化氮合酶

1、垂体腺苷酸环化酶激活肽对大鼠脑缺血再灌注后诱导性一氧化氮合酶表达的影响         11-06-05 16:20:00     作者：路文革 白宏英    编辑：studa20【摘要】  目的 探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注时氧化氮合酶（iNOS）在PACAP脑保护机制中的作用。方法 采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型，对36只大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和PACAP组，在大鼠脑缺血2h后进行24h、48h再

2、灌注，应用免疫组化法检测脑组织iNOS的表达。结果 脑缺血再灌注后，与假手术组比较，iNOS的表达量显著增加，阳性细胞数分别为60.02±4.23、80.36±6.24，P<0.01；应用PACAP后与缺血再灌注组比较，iNOS表达的峰值明显降低，分别为30.47±5.24、40.56±4.84，P<0.01。结论 PACAP能抑制大鼠局灶性脑缺血再灌注时iNOS的表达，这可能是其脑保护作用之一。 【关键词】  PACAP；脑缺血再灌注；iNOS       &#

3、160;  Effect of PACAP on the expression of iNOS in rats during transient focal cerebral ischemiareperfusion  Lu Wenge,Bai Hongying.The First Peoples Hospital of Shangqiu City,Shangqiu 476000,China 【Abstract】  Objective  To investigate the effect of PACAP on the activation an

4、d the expression of iNOS in cerebral cortex during transient focal cerebral ischemiareperfusion, and to discuss the probable mechanism of its protective effect.Methods  Thirtysix SD rats were randomly divided into 3 equal groups: sham operation group undergoing sham operation; ischemia/reperfus

5、ion(I/R) group undergoing thread embolism of the left middle cerebral artery occlusion(MCAO) to cause focal ischemia for 2 hours and then undergoing reperfusion; and PACAP group undergoing peritoneal injection of PACAP half hour after the ischemiareperfusion of MCAO.  Then the rats in the 3 gro

6、ups were redevided into subgroups of 6 rats, to be decapitated 24，48 hours after reperfusion for the later two groups, and their brains were taken out and fixed.  Immunohistochemistry was used to detect the expression of iNOS in the brain.Results  The expression values of iNOS in the ische

7、mic cortexes were significantly higher than those in the cortex of the sham operation group(P<0.01)，and were all significantly lower in PACAP group than those in the I/R group(all P<0.01).Conclusion  PACAP inhibits the activation and the expression of iNOS during focal ischemiareperfusion

8、 which may be one of the mechanisms of its neuroprotective function.    【Key words】  PACAP；Ischemiareperfusion；iNOS        研究表明,在脑缺血再灌注损伤过程中,NO的生成是重要的发病环节,引起细胞死亡或凋亡。NOS活性间接反映NO的生成能力。垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）具有神经营养、神经保护作用。其能否抑制缺血再灌注后iNOS的表达，目前国内外尚无动物试验的

9、文献报道。为此，本研究建立大鼠脑缺血再灌注模型，探讨iNOS在PACAP 脑保护机制中的作用。1  材料与方法1.1  实验动物及分组  健康SD大鼠36只，体质量（300±20）g，采用随即数值表分为假手术组、缺血再灌注组、PACAP组，每组12只。各组根据不同时间点又分为缺血2h 再灌注24h、48h组，每小组各6只大鼠。1.2  局灶性脑缺血再灌注模型的制作  用Koizumi线栓法1，建立大鼠局灶性脑缺血模型。以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰卧固定，分离并暴露左侧颈总及颈内、外动脉。结扎翼腭动脉，将栓

10、线从颈外动脉至颈内动脉，插入左侧大脑中动脉（MCA），遇阻即止，线栓前端颈内动脉起始处约（18.5±1.0）mm，阻断该侧MCA的血流供应。假手术组线栓深度为10mm。模型成功的大鼠在缺血2h后拔线至颈外动脉残端内进行再灌注。PACAP组于再灌注30min内，由微动脉注射，1×109mol/kg，1次/d。假手术组和脑缺血再灌注组，用等体积NS代替PACAP。1.3  脑组织石蜡切片的制备  各组大鼠分别于再灌注12、24h用10%水合氯醛过量麻醉，开胸暴露心脏，经左心室主动脉插管，先快速灌注37NS，随后灌注4%的多聚甲醛固定液0.01ml/l,开颅取

11、脑，于视交叉前后2mm处，将脑连续冠状切片，厚度为4mm,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切成3m厚的连续冠状石蜡切片。1.4  免疫组织化学染色  一抗iNOS购自北京中衫生物试剂公司，PACAP购自美国Sigma公司。3、3二氨基联苯胺（DAB）购自北京中衫公司。石蜡切片经常规脱蜡、水化、滴加一抗体后，按试剂盒说明书常规SP法对切片标本进行染色、DAB显色、蒸馏水洗、脱水、透明、封片。阳性染色为胞浆棕色颗粒。阴性对照以PBS代替一抗，余步骤同上。1.5  参考Longa  5分制评分标准2对其进行首次神经功能评分:0分,无神经损伤症状;1分,不能完全伸展

12、对侧前爪;2分,向对侧转圈;3分,向对侧倾倒;4分,不能自发行走,意识丧失。此后分别对各组大鼠再灌注后24h、48h进行评分。Longa评分为13分认为模型制作成功，评分为0分或4分则排除该标本。1.6  图象分析和统计学处理  切片在显微镜下放大400倍，随机选择6个不重叠的视野，统计阳性细胞数量，测得的数据用表示。应用SPSS 11.0统计软件，差异显著性检验采用t检验。以=0.05作为显著性检验标准。2  结果2.1  脑组织切片HE染色  假手术组大鼠大脑外观正常，无肿胀，表面血管清晰可见；缺血再灌注组大鼠缺血侧大脑半球与对侧相比肿胀明

13、显，MCA供血区苍白，无光泽，表面血管消失。脑组织切片显示：假手术组脑组织结构无明显异常；缺血再灌注组可见大量变性及坏死的神经细胞，少量胶质细胞，灶周有胶质细胞、炎性细胞；且随再灌注时间的延长而加重；PACAP组皮层缺血中心范围较小，病变较缺血再灌注组明显减轻。2.2  iNOS的表达结果  在假手术组和非缺血侧大脑半球内iNOS不表达。缺血再灌注组缺血侧半球大脑皮质内有明显的表达。iNOS阳性细胞于再灌注24h显著增多，再灌注48h增多非常显著。PACAP组与缺血再灌注组比较，各时间点的表达量均显著减少（P<0.01）。见表1。表1  3组大鼠大脑缺血皮质

14、内iNOS的表达结果（略）与缺血再灌注组比较P<0.013  讨论    近年来,大量的实验研究发现, 脑缺血再灌注损伤过程中,一氧化氮(NO)生成增多,尤其是再灌注过程中产生的NO可产生明显的神经毒作用,在缺血性脑损伤中起重要作用。在脑缺血再灌注损伤中,NO既有扩张血管,改善缺血组织血供,抑制血小板凝集,减轻缺血及再灌注损伤的作用3，又有介导和加重缺血及再灌注损伤的毒性作用。其中NO的浓度、产生部位、作用部位、产生时间等的不同以及NO氧化、还原状态决定了NO在脑缺血及灌注中的作用。适当浓度的NO对脑血流调节有十分重要的作用,对神经元具有保护作用,而过多的NO释放则表现出毒性作用,加重了脑缺血后的损伤程度。NO引起的毒性作用涉及到以下几个方面:(1)兴奋性氨基酸的过度释放、细胞内外钙平衡紊乱是缺血性脑损伤重要的病理生理过程,而NO可介导谷氨酸通过NMDA受体的过度兴奋引起NMDA受体依赖性钙通道开放,胞外钙离子大量内流,Ca2+或钙调蛋白可激活蛋白酶、磷脂酶、NOS、内源性核酸内切酶等,一系列的反应将导致膜脂质过氧化、自由基生成增加、膜通透性增强，最终导致细胞死亡。(2)通过铁蛋白产生毒性作用3。高浓度