中和试验法检测冻干卵黄抗体效价

1、PEDV-TGEVxXP黄抗体滴度测定中和试验一实验目的通过中和试验法测定PEDV-TGEV：联卵黄抗体效价。二材料1冻干PEDV-TGEV!联卵黄抗体3份2细胞PK-153病毒TGEV。4试剂DMEM,胰酶，D-Hanks液（无酚红），双抗，谷氨酰胺。5器材吸管、tip吸头、移液器、吸耳球、250ml瓶、500ml瓶、生物安全柜、酒精喷壶、细胞瓶、离心机等三方法1 PEDV-TGEVx卵黄抗体处理无菌条件下开启冻干卵黄抗体，按原冻干体积加入灭菌PBSm释冻干抗体。混匀后各取1ml,12000rpm离心5min。取上清200ul,56c水浴灭活30min,灭活后加入400UI双抗，保存备用。2

2、 PK-15细胞培养按常规细胞培养方法进行培养。3 毒液制备首先将种毒稀释至所需浓度，弃掉已长至单层的PK-15细胞生长液，将1ml种毒接种至细胞瓶内，置37恒温培养箱中吸附1小时，中间摇动12次。吸附完毕，向细胞瓶中加入37预热的维持液，置二氧化碳培养箱中继续培养并逐日观察细胞病变。当CPE&到75%至80%,向瓶内加入0.5ml甘油，然后冻融23次，4C、3000rpm离心2030min,弃沉淀，上清分装于小管中，置-70C保存备用。4 病毒液TCID50 测定4.1制备细胞悬液将长至单层的PK-15细胞按常规方法消化，计数后用维持液稀释至所需浓度获得细胞悬液。4.296孔细胞板制

3、备将上述计数完毕的细胞悬液加入各细胞孔中，200ul/孔，置于37cCO2培养箱中进行培养，约24小时可长至单层。4.3TCID50测定将病毒液用稀释液作10倍系列稀释，从10-110-10。取出已长至单层的PK-15细胞，弃掉原有营养液，各稀释度取50ul病毒液按顺序加入细胞培养板，记录加样顺序，每个稀释度做8孔，设正常细胞对照2孔，置于37CO2培养箱中孵育1小时。病毒吸附后，向细胞板中加入37预热的维持液，150ul/孔，并置于37cCO2培养箱中进行培养。5抗体中和试验按已建立的血清中和试验方法，将卵黄抗体稀释至所需浓度进行中和试验对各样品进行检测，本实验共检测3份冻干卵黄抗体样品，各

4、样品分别做两个平行。四结果1PK-15细胞培养结果PK-15细胞培养24小时后，显微镜下可见细胞已长至单层，且较为健壮，圆润。2毒液TCID50检测结果细胞板接毒后观察至第二天，低稀释度的病毒出现病变；第三天时病变数继续增加，进行结果判定并记录。由Reed-Muench法计算出本次病毒液TCID50=105.43/50ul。3冻干卵黄抗体中和试验结果按既定试验方法进行冻干卵黄抗体样品中和试验，并观察与计算，结果见表1。表1冻干卵黄抗体中和试验法检测结果xx1滴度xx2滴度GMT样品样品1888样品2888样品3787.5五分析与讨论1 本次检测方法采取已建立的血清中和试验方法进行卵黄抗体检测，结果表明该方法同样适用于卵黄抗体的检测。其中对样品的处理均同血清处理。2 高免血清检测结果其中和效价GMT为8.6，而本次卵黄抗体检测结果GMT为3 .0，比高免血清几何平均中和效价要高低0.6个滴度，分析可能是由于车间初次试制提取以及浓缩不够完全导致结果