缺血再灌注对一氧化氮和细胞凋亡的影响及促肝细胞生长素的干预研

1、论著文章编号:1005-2224(200810-0767-04缺血再灌注对一氧化氮和细胞凋亡的影响及促肝细胞生长素的干预研究岳屹囡1,毕宁康2,蒋红雨3作者单位:1.山东省济宁市第一人民医院,山东济宁272000,2.山东省济宁市第二人民医院,山东济宁272049,3.贵阳医学院附属医院,贵州贵阳550004E -mail:yyngy【摘要】目的观察促肝细胞生长素(pHGF 对肾缺血再灌注损伤大鼠肾功能及肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法雄性Sp rague 2Da wley 大鼠32只,随机分为假手术对照组(组、缺血再灌注组(组、缺血再灌注前pHGF 干预组(组和缺血再灌注后pHGF 干预组(组

2、。用无损伤动脉夹钳夹大鼠双侧肾蒂45m in 制成肾缺血再灌注损伤(R I R I 模型。假手术组只暴露双肾,不钳夹肾蒂。组和组分别在术前和术后腹腔注射pHGF50mg/kg 。检测术后12h 血清肌酐(Scr 和NO 的浓度及肾小管上皮凋亡阳性细胞表达。结果组血清NO 和Scr 水平(1371846±221317mol/L 、(120185±221237mol/L 明显高于组(73198±81356mol/L 、(221775±61508mol/L;P <0101,各项在组(1011304±161518mol/L 、(601413

3、77;101197mol/L 和组(1041778±261911mol/L 、(691400±111443mol/L 的表达水平明显较组下降(P <0101。组肾小管损伤程度评分和肾脏凋亡阳性细胞的表达(11950±01093分、(261850±11476个均较组(01125±01117分、(01900±01385个明显升高(P <0101,两项指标在组(01913±01125分、(81300±11146个和组(01888±01136分、(91000±01869分均较组显著下调(P

4、<0101。组和组间各项值比较差异均无统计学意义(P >0105。结论pHGF 能显著降低血清NO 和Scr 水平,能显著抑制肾小管上皮细胞凋亡,对I A RF 在肾脏结构及功能上既有保护作用又有治疗作用。【关键词】促肝细胞生长素;肾;再灌注损伤;一氧化氮;细胞凋亡中图分类号:R72文献标志码:AEffects of hepa tocyte growth 2pro m oti n g factor on apoptosis i n k i dney of ra ts w ith rena l ischem i a reperfusi on i n 2jury.YU E Yi 2na

5、n,B I N ing 2kang,J I AN G Hong 2yu .D epart m ent of paediatrics,First Hospital,Shandong J ining 272000,ChinaAbstract O bjecti ve To investigate the effects of hepat ocyte gr owth 2p r omoting fact or (pHGF on apop t osis and renal ischem ia reperfusi on (I R injury in rats .M ethods Thirty 2t w o

6、male Sp rague 2Da wley rats were divided int o f our gr oup s (n =8:Sha m 2operated contr ol gr oup (Gr oup ,renal I R contr ol gr oup (Gr oup ,one experi m ental gr oup injected pHGF (50mg/kg,intraabdom inal injecti on before renal I R injury (Gr oup ,and another experi m ental gr oup injected pHGF

7、 (50mg/kg,intraabdom inal injecti on after renal I R injury (Gr oup .The ani m als with renal I R injury were ex 2posed t o 452m in bilateral renal pedicle cla mp ing .A ll the rats in Gr oup and were intraabdom inally injected equal volu me of physi ol ogical saline (018m l at the ti m e when the r

8、ats in experi m ental gr oup s were ad m inistered 018m l pHGF .T welve hours after I R injury,sa mp les for seru m and the left renal tissue of each ani m al were taken .The seru m sa mp le was f or analysis of exp ressi on of creatinine (Scr and NO,and the renal tissue samp le for evaluati on of a

9、pop t osis and renal tu 2bular ep ithelial cells injury degree score .Results Compared with Gr oup ,the exp ressi on of serum NO and Scr (73198±81356and 221775±61508res pectively was markedly higher in Gr oup (1371846±221317and 120185±221237corres pondingly,P <0101,while seru

10、m NO and Scr p r oducti on in Gr oup (1011304±161518and 601413±101197res pectively and Gr oup (1041778±261911and 691400±111443res pectively were l ower than those in Gr oup (bothP <0101.The renal tubular ep ithelial cells injury degreescore and apop t osis cells showed signifi

11、cant increased values inGr oup (11950±01093and 261850±11476res pectively incomparis on with Gr oup (01125±01117and 01900±01385res pectively,P <0101.The data with regard t o the injury de 2gree score and the cell nu mbers of apop t osis markedly reduced in Gr oup(01913±011

12、25and81300±11146corre2 s pondinglyand Gr oup(01888±01136and91000±01869corres pondinglycompared with those in Gr oup(P <0101.No statistical significance was detected bet w een Gr oupand Gr oupconcerning any detected para meters in the study(P>0105.Conclusi onThe laborat ory inves

13、tigati on suggests that pHGF m ight be an effective phar macol ogi2 cal agent against renal I R injury according t o the findings of the evaluated para meters,and p r otective effect by pHGF a2 gainst renal I R injury m ight be involved in the mechanis m s up regulating NO p r oducti on and decreasi

14、ng tubular cells apop2 t osis.It is likely that pHGF is a potential therapeutic agent in clinical renal I R injury circu m stances.KeywordsHepat ocyte gr owth2p r omoting fact or;Kidney;Reperfusi on injury;NO;Apop t osis急性肾功能衰竭是常见的临床危重病症之一。近年研究表明细胞凋亡在肾缺血再灌注损伤(I R I的病理过程中起重要作用122。肝细胞生长因子(HGF是一种多效性的生长

15、因子,具有促有丝分裂、促细胞增殖、促形态发生、促血管形成、抗凋亡等作用324,HGF已广泛应用于肝脏疾病的治疗,但在肾脏领域应用尚少。本实验旨在观察HGF对大鼠肾I R模型血清一氧化氮(NO表达及肾小管上皮细胞凋亡的影响,以探讨HGF在肾I R I中的可能作用机制。1材料与方法1.1实验动物和分组健康、雄性Sp rague2Da wley大鼠32只,体重100120g,购于贵阳医学院实验动物中心,置于1822实验室安静饲养57d。随机分为假手术对照组(组、缺血再灌注组(组、缺血再灌注前促肝细胞生长素(pHGF干预组(组和缺血再灌注后pHGF干预组(组,每组8只。1.2动物模型制作与标本采集2%

16、戊巴比妥钠3040mg/kg腹腔注射麻醉,无菌条件下腹部正中线切口,顿性分离组织,用无损伤动脉夹钳夹双侧肾蒂45m in造成缺血性急性肾衰竭(I A RF动物模型(实验过程中动物体温维持在37左右,钳夹松开时,如果肾脏颜色由暗紫色转红色说明急性肾功能衰竭(ARF模型成功。缝合伤口后安静饲养。于再灌注12h,股动脉采血,处死动物后迅速摘取左侧肾脏,中性福尔马林固定。假手术组仅暴露双侧肾脏,不钳夹肾蒂。所有动物均在术前半小时和术后即刻分别给予生理盐水018mL腹腔补液。组在术前补液时给予pH2GF50mg/kg,等量(018mL生理盐水稀释。组在术后补液时给予pHGF50mg/kg。1.3检测指标

17、和方法用Beck man全自动生化分析仪采用酶法检测Scr。采用硝酸还原酶法检测血清NO水平(NO试剂盒购于晶美生物工程有限公司。NO化学性质活泼,与分子氧反应生成NO2,很快转化为NO-3和NO-2,采用硝酸还原酶特异性地将NO-3还原为NO-2,NO-2与显色剂作用生成有色物质,通过显色深浅测定其浓度的高低,操作按试剂盒说明书进行,在721紫外分光光度计上选择530n m波长,015cm比色杯,空白管调零,读取OD值后,NO 的浓度为测定管与标准管OD值的比值乘以100(mol/ L。肾组织原位细胞凋亡标记(T UNE L检测肾小管上皮细胞凋亡,试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。参照

18、试剂盒说明书;石蜡切片常规脱蜡、脱水;蛋白酶K室温孵育20m in,P BS冲洗2×10m in;滴加50L T UNE L反应混合溶液,37孵育60m in,P BS冲洗3×10m in;加入50L P OD转化剂,37孵育30m in,P BS冲洗3×10m in;滴加100L DAB底物溶液,37孵育30m in,P BS冲洗3×10m in;苏木素衬染,封片,光镜观察。同时设阳性及阴性对照。凋亡切片中,凋亡阳性细胞着色呈棕黄色;采用B i om2 ias99图象分析系统进行图象分析。在40×10倍光学显微镜下,通过S ONY摄像头将实验

19、鼠组织免疫组化图象采集并输入本图像分析系统进行图象分析。每张切片随机选取5个区域(视场,计数阳性细胞数,最后取平均值。肾组织切片HE染色,盲法显微镜下观察肾组织学改变。肾小管损伤程度评分参考文献5的标准,在200倍光镜下每张切片随机选取10个视野不相重叠皮髓区肾小管,根据每个肾小管病变(肾小管扩张、变性、坏死累及的小管数目进行评分,最后取平均值。0分:肾小管结构正常,不见任何病变;1分:肾小管病变数目<3个;2分:肾小管病变累及数目35个;3分:肾小管病变数目>5个或肾小管结构消失。1.4统计学处理数据应用SPSS1210统计分析软件包处理,组间差异采用单因素方差分析;方差齐性采用

20、LS D法,方差不齐采用Ga mes2Howell法。P<0105表示有统计学意义。2结果2.1肾脏病理改变组肾小球及肾小管无明显异常,肾组织结构基本正常;组肉眼见肾皮质苍白,髓质淤血暗红,HE染色光镜下肾小球明显淤血、肿胀、红细胞渗出、肾小囊腔变窄,肾小管上皮细胞崩解、变性、脱落,管腔扩张,可见蛋白管型和红细胞管型,同时可见管壁剥离和断裂;组和组组织病理学改变基本相同,比组轻,肾小球基底膜较完整,淤血明显减轻,肾小管上皮细胞变性轻,管腔扩张以及管腔中的脱落绒毛和上皮细胞少,偶见蛋白管型和细胞管型,罕见管壁剥离和断裂。2.2各组大鼠血清NO和Scr水平的比较NO水平的比较:假手术组NO水

21、平较低,缺血再灌注组显著升高,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0101;pHGF术前干预组和术后干预组NO表达均低于缺血再灌注组(P<0101,但干预组两组之间差异无统计学意义(P>0105。见表1。表1各组大鼠血清NO和Scr水平的比较( x±s组别例数NO(mol/LScr(mol/L组873.980±8.35622.775±6.508组8137.864±22.3171120.850±22.2371组8101.304±16.5181260.413±10.19712组8104.778±26.

22、91112369.400±11.443123注:1与组比较P<0101;2与组比较P<0101有统计学意义;3与组比较P>0105Scr水平的比较:缺血再灌注组明显升高,与假手术组比较差异有统计学意义(P<0101;pHGF干预后Scr明显下降,与缺血再灌注组比较差异有统计学意义(P< 0101,但干预组两组之间差异无统计学意义(P>0105。2.3各组大鼠肾小管损伤程度评分及细胞凋亡的比较肾小管损伤程度评分的比较:假手术组肾小管损伤较少见。组肾小管损伤程度评分显著高于假手术组(P<0101;经pHGF干预后,组和组肾小管损伤程度明显减轻,评

23、分降低,与组比较差异均有统计学意义(P<0101,但组和组之间差异无统计学意义(P>0105。见表2。表2各组大鼠肾小管损伤程度评分及细胞凋亡的比较( x±s组别例数肾小管损伤程度评分(分细胞凋亡(个组80.125±0.1170.900±0.385组8 1.950±0.093126.850±1.4761组80.913±0.125128.300±1.14612组80.888±0.1361239.000±0.869123注:1与组比较P<0101;2与组比较P<0101;3与组比较P&

24、gt;0105细胞凋亡比较:假手术组仅见微量表达,缺血再灌注损伤后凋亡阳性细胞数明显增加,与假手术组比较具有统计学意义(P<0101;用pHGF干预后,凋亡阳性细胞数明显下降,与组比较差异具有统计学意义(P<0101,但组和组之间差异无统计学意义(P>0105。2.4血清NO与肾小管上皮细胞凋亡的相关性分析经统计学处理,血清NO与凋亡阳性细胞数呈正相关(r= 0178,P<0101。3讨论凋亡又称细胞程序化死亡(PCD,它是一种主动耗能的多种基因参与调控的细胞自我毁灭过程。有人证实在肾I R I时,可见到大量的肾小管上皮细胞凋亡6。我们的研究结果观察到,大鼠肾脏缺血再灌

25、注12h可见肾脏凋亡细胞数、肾小管损伤程度评分和Scr较假手术组明显增加,差异有统计学意义(P<0101。HE染色提示I R12h肾小管上皮细胞结构不清,排列紊乱、崩解、脱落、灶性坏死,充分说明凋亡与坏死共同存在于同一模型中,严重影响肾功能。资料表明(NO在肾小球、肾血管和肾小管功能稳态调节中发挥着重要作用,不同水平、不同部位的一氧化氮合酶(NOS被阻断,对肾脏生理将产生不同的影响。NOS是NO生物学效应主要、惟一的限速因子7。缺血再灌注对诱生型NOS(i N OS有明显的诱导作用,而i N OS的高表达可加重肾脏损伤8i N OS被诱导后将催化产生大量NO, NO与氧迅速反应生成大量氧

26、自由基,引起脂质过氧化反应,导致膜脂质的损伤。NO与超氧阴离子还可以生成过氧亚硝酸阴离子(per oxynitrite ani on,ONOO-,具有更强的氧化和损伤作用9。NO/ONOO-可通过增加促凋亡蛋白Bax的表达诱导凋亡10。Caigan等11研究证实NO可通过活化Cas pase28使核酸内切酶激活诱导肾小管上皮细胞凋亡。在用促炎因子Il21培养的成心肌纤维细胞的实验研究中发现,Il21诱导i N OS的表达,促进NO的产生,而i N OS及其产生的NO能增强Cas pase23活性促进凋亡12。Joao等13研究证实肾缺血再灌注时,i N OS被显著上调,NO 产生增多,肾小管上

27、皮细胞出现大量凋亡。我们的研究结果发现,大鼠肾缺血再灌注12h血液NO的表达水平明显升高,与上述学者的研究结果一致,与假手术组比较,有统计学意义。HGF分肝源性(肝再生刺激物质,HSS和血源性两种。在我国HSS又称为促肝细胞生长素(pHGF,它能刺激肝细胞DNA合成及肝细胞再生,并对肝细胞具有保护作用14。刘树人等15在对急性肝损伤的研究中,发现pHGF 可降低肝损伤小鼠血中NO的水平,从而减轻肝损伤的程度。在对肝脏缺血再灌注大鼠的研究中,关景明等16证实pHGF具有减轻缺血再灌注引起的肝细胞凋亡的发生,使肝损伤减轻的作用。pHGF已广泛应用于肝脏疾病的治疗及防护,但在肾脏领域应用尚少。Har

28、uhit o等17在研究同种异体移植物肾病(C AN时证实,HGF通过抑制i N OS的产生而阻止C AN的发生发展。给予外源性HGF,能阻止肾I R I皮质小管凋亡和急性肾功能衰竭18。我们的实验显示,经pHGF干预处理后,血液NO、Scr水平、肾小管损伤程度评分及肾小管上皮细胞凋亡细胞数明显下降,显著低于缺血再灌注组。血清NO与肾小管上皮细胞凋亡呈正相关,血清NO的水平与细胞凋亡表现出变化的一致性。这表明肾I R I时,NO介导了肾小管上皮细胞凋亡,pHGF能抑制肾小管上皮细胞凋亡,保护肾功能,其机制与降低血液NO水平有关。本文结果发现不管是在肾脏缺血前还是在缺血再灌注后给药均获得疗效,包

29、括肾功能、肾脏组织病理学以及细胞凋亡和血清NO的表达,并且两组间差异无统计学意义。说明pHGF对肾I R I既具有保护作用又具有治疗作用。HGF对肾脏疾病的治疗和保护作用已在基础研究中得到广泛的证实,但细胞因子网络非常复杂,在实际临床应用中,其具体的应用时间点及精确的有效剂量应是我们进一步的研究课题。参考文献1Castaneda MP,S wiatecka2U rban A,M itsnefes MM,et al.Activa2ti on of m it ochodrical apop t otic pathways in human renal all ograftsafter ische

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