高效液相色谱_荧光法测定蔬菜中的黄酮

1、营养学报 2009年第 31卷第 2期 191高效液相色谱-荧光法测定蔬菜中的黄酮Quantitative Determination of Flavonoids in vegetable by HPLC withfluorescence detector吴 波,张寒俊,胡志雄(武汉工业学院分析测试中心 WU Bo, ZHANG Han-jun, HU Zi-xiong(Center of Analysis and Measurement, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China 在日常膳食中,黄酮类物质通常表现为具有抗氧化性的羟基衍

2、生物形态,天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖等生物活性。本研究旨在建立用高效液相-荧光法对蔬菜中黄酮进行测定1,2。1 对 象 与 方 法1.1 仪器VARIAN ProStar 210泵;7725I 型手动进样器;VARIAN363荧光检测器;ProStar335PDA(二级管阵列检测器;Waters 柱后衍生系统。1.2 试剂槲皮素(quercetin QU (含量98%国药集团化学试剂公司 ,桑色素(morin hydtate MO(含量98%购于 Fluka ,山奈酚(kaempferolKA (含量98%上海友思 ; 异鼠李素 (isorham

3、ne- tin ISO (含量99%中国药品生物制品检定所 ; 甲醇(色谱纯 ;水(自制双重蒸馏水 ;其它试 剂为分析纯。所有样品购于武汉商储市场。 1.3 方法 1.3.1样品处理 4,5:称取捣碎的豆角、青椒、四 季豆、汤菜、苋菜、小白菜、油麦菜、韭菜花、 小葱湿样约 30 g于 250 ml碘量瓶中,准确加入 100 ml无水乙醇,称重,50振荡浸取 2 h后,补 足乙醇,摇匀。取 5.00 ml浸取液,加入 1 ml浓 HCl(含 0.2 g/ml苯酚通 N 2、封口,在 80下水 解 2 h后,用无水乙醇定容于 10 ml量瓶中,置 于冰箱中(-20冷冻 1 h,取出超声波振荡 5

4、min,后(10 000 r/min, 40s离心,待测。 1.3.2色谱条件:色谱柱:Nucleodur C18(4.6×250 mm,5 m,流动相:A相为 0.1 mol/L HAc, B 为甲醇;流速 0.30 ml/min;柱温 40;进样 20 l 。 梯 度 程 序 :08 min, A 70%25%, B 30%75%; 815 min, A-B(25:75; 15 15.06 min, A 25%0%,B 75%100%; 15.06 20.1 min,A-B(0:100;20.120.12 min, A 0% 70%, B 100%30%。激发波长 438 nm,

5、发射波长 483 nm。 1.3.3对照品溶液配制:准确称取桑色素、槲皮 素、山奈酚和异鼠李素各 5.00 mg,用无水乙醇 溶解并分别定容在 10 ml的量瓶中,分别得到 0.50 g/L,相应的黄酮对照品储备液,避光保存。 1.3.4衍生剂配制:聚氧乙烯月桂醚 0.3 g,冰 醋酸 1.5 ml,60% AlNO3 1 ml,溶于 500 ml无水乙 醇,衍生泵流速 1.00 ml/min,衍生圈长 1 m。 2 结 果 2.1 系统适用性 (图1 桑色素、槲皮素、山奈酚和异鼠李素在本色谱条件下其保留值分别为 23.1、24.4、27.4、 28.1 min。用二极管阵列检测器对桑色素、槲

6、皮 素、山奈酚、异鼠李素相应色谱峰上不同点位上 (200400 nm与相应对照品的紫外光谱是一致 的,证明该峰就是相应对照品的色谱峰(图 1。 2.2 标准曲线的制作与检出限(表 1 分别准确量取对照品储备液 5、10、20、40、80、 160l, 用无水乙醇配成相应浓度的标准液, 进样 20 l。以相应组分的色谱峰面积(Y对其收稿日期 2008-12-12 作者简介 吴波(1962- ,男,硕士,副教授, E-mail:wb中图分类号 R151.3 文献标识码 B 文章编号 0512-7955(200902-0191-02浓度(X g/ml作线性回归。在选定色谱条件下,测定桑色素、槲皮素、

7、 山奈酚、异鼠李素的检测限,结果表明检测限 (S/N=3分别为2、1、3、3 ng。 A :standard solution; B :sample solution; 1. morin hydtate;2. quercetin 3. kaempferol 4. isorhamnetin Fig.1 Chromatograms of standard and sample solution(small colzaTable 1 Linear relation of the flavonoidsComponent Linear equation r Linear range (mg/LMO y=

8、239558x-125773 0.9997 0.25-8.0 QU y=103938x-32804 0.9994 0.25-8.0 KA y=76814x-27192 0.9998 0.25-8.0 ISO y=45338x-27762 0.9996 0.25-8.02.3 方法回收率取已知量(桑色素未检出;槲皮素3.46 mg/kg; 山奈酚40.5 mg/kg;异鼠李素7.12 mg/kg的小白 菜15.00 g,精密加入桑色素、槲皮素、山奈酚、异 鼠李素对照品储备液各0.10、1.00、0.20 ml ,同1.2.1方法制备溶液,按上述色谱条件测定,样 品中桑色素、槲皮素、山奈酚、异鼠李

9、素的平均 回收率分别(n =3为93.1%、 93.5%、 98.1%、 102.7%, RSD分别为1.97%、2.35%、2.19%、2.29%。表明回 收率良好。2.4 精密度、重复性及稳定性实验取浓度分别为1.00 mg/L桑色素、槲皮素、山 奈酚、异鼠李素的对照品混合液,重复5次进样, 测 定 其 峰 面 积 ,计 算 相 应 的 RSD分 别 为 1.61%、 2.09%、2.29%、2.37%,将上述对照品混合液分 别在室温放置0、2、4、6、8、18、24 h进样,测 定相应的峰面积, 其波动RSD<3%; 取同一批小白 菜样品共5份,重复测定,求得槲皮素、 山奈酚、 异

10、 鼠李素RSD为2.02%、2.36%、2.01%。 2.5 样品的测定(表 2将桑色素、槲皮素、山奈酚、异鼠李素的对 照品储备液用乙醇逐级稀释、 混合,配成对照品溶液系列,分别进样20 l;对样品按“1.2.1”项进行处理,进样20 l。采用外标法计算。Table 2 The flavonoids determined in vegetables(n =3Component (mg/kg SampleMO QU KA ISO1 2.50±0.079 ND ND 2 8.06±0.10 ND ND 3 3.07±0.11 ND ND4 <1.60 3.62&

11、#177;0.12ND5 <1.60 3.26±0.12ND6 3.46±0.13 40.5±1.357.12±0.287 8.79±0.21 ND ND 8 11.3±0.19 60.1±1.18ND 9 ND10.7±0.32 18.2±0.61ND ND :not detected; 1 cowpea (豆角 ; 2 blue junction (青椒 ; 3 jack bean (四季豆 ; 4 tang cai (汤菜 ; 5 three-color amaranth (苋菜 ; 6 sm

12、all colza (小白菜 ; 7 naked oats vegetable (油麦菜 ;8 fragrant-flowered garlic cauliflower(韭菜花 ; 9 shallot(小葱3 结 论(1 采用荧光检测器, 其响应信号的选择性 要好于紫外检测器。 (2柱后衍生时,其溶剂极 性对黄酮所产生的荧光强度有影响,乙醇所占的 比例要大于90%。 (3 流动相中不能添加磷酸, 以 避免相应沉淀物的形成。关键词:槲皮素; 桑色素; 山奈酚; 异鼠李素;高效液相色谱法(HPLC; 蔬菜Key words:quercetin ; morinhydrate ; kaempferol ;isorhamnetin ; HPLC ; vegetable参 考 文 献1 徐静,郭长江,韦京豫,等. 蔬菜中类黄酮物质的高效液相色谱测定法J.营养学报, 2005,27:276-279.2 陈晓岚,于斐,屈凌波,等.荧光及ESI质谱法研究溶菌 酶 与 磷 酰 化 黄 酮 的 相 互 作 用 J. 化 学 学 报 , 2