西维来司钠对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

1、西维来司钠对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用         10-09-13 14:44:00     作者：胡月 董志 晏飞    编辑：studa20【摘要】  目的 探讨西维来司钠(ONO5046)对大鼠全脑缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用及其机制。方法 SD大鼠随机分为假手术组、I/R组和I/R+ONO5046组，I/R组和I/R+ONO5046组根据再灌注时间的不同分为6、12、24、48 h四个亚组。采用四血管阻

2、断法制备I/R模型，缺血15 min，I/R+ONO5046组于再灌注时经股静脉持续给予 ONO5046 2 mg·kg-1·h-1，假手术组和I/R组给予生理盐水。观察大鼠脑组织病理学变化，并检测中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、丙二醛 (MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、肿瘤坏死因子(TNF)活性。结果 I/R后，NE含量随再灌注时间延长而不断增强(P0.05或P0.01)，TNF表达量也增加并于再灌注12 h达最高峰(P0.01)。ONO5046组显著降低缺血再灌注后脑组织NE、MDA含量，升高SOD活性以及减少TNF表达，明显改善脑组织病理形态。结论 ONO504

3、6对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，其机制可能与降低NE、MDA含量，升高SOD活性及下调TNF阳性表达细胞有关。 【关键词】  西维来司钠；缺血再灌注；中性粒细胞弹性蛋白酶；肿瘤坏死因子    【Abstract】Objective  To investigate the protective effect and its mechanism of sivelestat sodium hydrate (ONO5046) on brain of ischemiareperfusion (I/R) rats. Methods  The

4、 model of I/R was induced by fourvessel occlusion method, ischemia 15 min, reperfusion 4, 8, 12, 24 and 48 h. The histopathological change of brain was observed. The contents of neutrophil elastase (NE) and malondialdehyde (MDA), activities of superoxide dismutase (SOD) and the expression of tumor n

5、ecrosis factor (TNF) in brain were measured. Results  After I/R, the content of NE increased with the I/R time delaying (P0.05, P0.01), the level of TNF expression increased rapidly and reached peak at 12 h after reperfusion. Compared with model group, ONO5046 improved histopathological injury,

6、 markedly decreased NE and MDA levels, increased SOD activity and decreased the expression of TNF.Conclusions  ONO5046 has protective effects on brain of I/R, which might be associated with decreasing of NE and MDA contents, increasing of the activity of SOD and downregulating the expression of

7、 TNF.    【Key words】Sivelestat sodium hydrate; Ischemiareperfusion; Neutrophil Elastase; Tumor necrosis factor脑缺血再灌注后继发性炎症反应是导致脑损伤加重的主要原因之一，中性粒细胞的聚集、浸润是炎症反应发生、发展的关键步骤。中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)存在于中性粒细胞中，在生理情况下，它对机体防御功能非常重要。在炎症情况下，激活的中性粒细胞释放大量的NE至细胞外，NE可降解几乎所有的白细胞外基质成份,袭击完整的细胞,

8、导致内皮细胞脱落,血脑屏障由此遭受严重的破坏。白细胞由破坏的血脑屏障进入脑实质直接攻击正常组织,也使梗死体积扩大。研究表明，西维来司钠(Sivelestat sodium hydrate，ONO5046)对肺和心肌的缺血再灌注损伤均有明显的保护作用1，2，但ONO5046在脑缺血损伤中的作用少有报道。本研究选用大鼠全脑缺血模型，观察ONO5046在脑缺血再灌注损伤中的作用，并对其可能作用机制进行研究。1  材料与方法1.1  动物 雄性SD大鼠，23月龄，体重250300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机分为假手术组(Sham组，12只)，缺血再灌注组(I

9、/R组，48只)，西维来司钠处理组(I/R+ONO5046组，48只)。I/R组及I/R+ONO5046组根据再灌注时间不同再分为6、12、24、48 h四个亚组，每个亚组12只。1.2 试剂与仪器 ONO5046(纯度99.5%,批号：G030620)，由重庆医药工业研究院提供；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Rat Neutrophil elastase ELISA试剂盒购自MARKET INC；肿瘤坏死因子(TNF)抗体、SABC免疫组化试剂盒由武汉博士德公司提供。大鼠脑立体定位仪(西北光学仪器厂)；微量输液泵(江苏沙洲实验仪器厂)；

10、台式离心机(上海鸽牌)；721分光光度计(上海光电)；显微镜H2(日本OLYMPUS)；BI2000免疫组化分析系统(成都泰盟科技公司)。1.3 模型制备 I/R组和I/R+ONO5046组采用PulnelliBrierley 四血管阻断法建立大鼠脑缺血模型。大鼠颈部背侧切口，暴露第一颈椎两侧翼小孔，电凝针凝闭双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合皮肤切口，放回鼠笼。手术24 h后，乙醚麻醉固定大鼠，颈前切口游离双侧颈总动脉。穿线提出颈总动脉，待其清醒后，用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉造成全脑缺血，以大鼠昏迷、剪趾无反射作为模型成功标志。缺血15 min后，松开动脉夹恢复脑血流，缝合颈部伤口

11、。Sham组仅暴露双侧翼小孔和双侧颈总动脉，不行阻闭。1.4 给药方法 I/R+ONO5046组于再灌注时用微量输液泵经股静脉输注ONO5046生理盐水，用药量为2 mg·kg-1·h-1，持续输注3 h；Sham组和I/R组输注等量生理盐水。1.5 检测指标1.5.1 脑组织病理学观察 每组随机选取4只大鼠，再灌注结束后，4%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧打开胸腔，经左心室插入针头至升主动脉，剪开右心耳，用生理盐水200 ml灌注冲洗，再用40 g/L多聚甲醛缓慢灌注固定，开颅取脑。常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察大鼠双侧海马神经元改变。1.5.2 NE、MDA含量及SOD活性测定 各组大鼠再灌注后脱颈处死，称取脑组织，预冷的生理盐水10倍稀释后，冰浴下充分匀浆，4 000 r/min离心10 min，吸取上清液待用。采用双抗夹心ELISA法检测大鼠脑组织中NE含量(ng/ml)，采用TBA显色法测定MDA含量(nmol/mgprot)，化学发光法测定SOD活性(U/mgprot)。1.5.3 脑组织中TNF测定 采用免疫组织化学法检测大脑皮质TNF表达。