重组猪_干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达

1、18卷3期2002年5月生物工程学报ChineseJournalofBiotechnologyVol.18No.3May2002重组猪干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达陈涛于瑞嵩12312,3刘惠莉2,3李震2,33曹祥荣(南京师范大学生命科学学院,南京210097)(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)(上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)第86位Cys(TGC)突变为Tyr(TAC),同时将其成摘要用巨引物PCR法介导的定点突变把猪干扰素(PoIFN2熟蛋白N端第一个密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC,构建了大肠杆菌融合基因表达载体pGEX2IFN

2、,表达产物占菌体总蛋白的20%。将以包涵体形式表达的目的蛋白经变、复性处理,并以FPLC进一步纯化,得到了具有较高生物活性的产物(5200IUmg)。关键词猪干扰素,巨引物PCR,定点突变,包涵体中图分类号Q78文献标识码A文章编号100023061(2002)032204干扰素是动物中目前所知出现最早、作用最快的第一抵御病毒体系。研究,猪大国,、,发展具。)基因无内含子,蛋白糖猪型干扰素(PoIFN2基化修饰也不重要1200购自Phamacia公司,。人羊膜上皮细胞(WISH)及水疱性口炎病毒(VSV)购自卫生部上海生物制品研究所。112方法411211定点突变:采用巨引物PCR法。根据所得

3、序列2设计3条引物:PoIFN2P1:5CGACCTGCCTCA3;P2:5GCTGATCCAGTCCAGTGTAGAAC3;P3:5CAATGGGCTTG3。,因而方便利用原核表达载体表达。我们在研究中克隆到编码猪型干扰素成熟肽部分的基因片段并在大肠杆菌中进行了表达,发现其活性较低,估计其编码肽段的第86位Cys可能影响了干扰素的抗病毒活性。本实验参照1PoIFN21序列将此位点突变为Tyr,然后用大肠杆菌融合表达系统表达出GST2IFN融合蛋白,目的产物纯化后具有较高的抗病毒活性。32其中P1处于IFN基因的5端,斜体C为引入的突变碱基,并在前面加了GATCC(下划线部分),以便与经Bam

4、HI酶切后用S1核酸酶削平的载体进行平端连接构成新的BamHI酶切位点。P2处于IFN基因内部,斜体T为引入的突变碱基。P3处于IFN基因的3末端,下划线部分为引入的EcoRI酶切位点(引物示意参见图1)。1材料与方法111材料、菌种和质粒:受体菌E.coliDH5E.coliBL21为本室保藏菌种;pGEX24T23载体购自Pharmacia公司;pUCm2IFN质粒为本室构建、保存。工具酶和试剂:PfuDNA聚合酶购自上海生工生物工程公司,限制酶、T4DNA连接酶、S1核酸酶标准品购自卫生部上海购自TaKaRa公司,HuIFN2收稿日期:2001212217,修回日期:2002202228

5、。基金项目:上海市农科院重点学科青年科技骨干培养基金。3通讯作者。Tel:86221262200389;Fax:86221262207858;E2mail:zhenli60图1引物示意图Fig.1PositionofprimersTheasterisk(3)indicatesthesitestobemutated340生物工程学报18卷以P1、P2为引物,pUCm2IFN质粒为模板,用Pfu聚合酶进行扩增,条件为95预变性3min,9530s,62退火及延伸50s,25个循环,产物用低熔点琼脂糖法割胶回收,记为U。再以U、P3作引物,pUCm2IFN质粒为模板,用Pfu聚合酶进行扩增,扩增条件

6、:95预变性3min,9530s,62退火及延伸80s,30个循环,所得产物即为突变后IFN。暂记作rPoIFN21。11212表达质粒的构建:构建过程参见图2。用1%低熔点琼脂糖凝胶分离回收Pfu聚合酶扩增的rPoIFN21,以EcoRI酶切。载体质粒pGEX24T23经BamHI酶切后,以稀释的S1核酸酶削平,再以EcoRI酶切,酚:氯仿:异戊醇抽提后,与酶切后的浓度1mgmL,诱导3h后离心收集菌体。11214表达产物纯化:(1)细胞破碎及包涵体洗涤:以超声波破碎诱导后菌体,离心后沉淀用适量包涵体洗涤液(20mmolLTrisHCl,pH810,5mmolLEDTA,0102%溶菌酶,7

7、5gmLPMSF,75gmL苯甲酰胺)重悬,室温下置于磁力搅拌器上搅拌1h。加0125体积10%(WV)脱氧胆酸钠,使其终浓度为2%(WV),继续搅拌1h。室温17000g离心20min。沉淀以2%(WV)脱氧胆酸钠的包涵体洗涤液重复洗涤1遍。(2)变性溶解配置变性缓冲液:8molL尿素,50mmolL甘氨酸,0125molL2巯基乙醇,75gmLPMSF,75gmL苯甲酰胺,011molLTrisHCl,pH911。溶解洗涤后的包涵体,使蛋白浓度约为115mgmL,室温搅拌,。(3):0TrisHCl,pH911配制17mol2PAGE凝胶电泳检测目,大致估算折叠中点。,将变性溶解的包涵体于

8、5倍体积此缓冲液中透析2遍,以使其缓慢通过折叠中点。再将其对5倍体积BLM(0125%碳酸氢钠,0120%甘露醇,0120%乳糖)透析过夜。最后对PBS透析。(4)FPLC纯化:由于透析后蛋白溶液体积较大,浓度较低,而FPLC上样量有限,故需先用Sarto2rius超滤系统对10000D滤膜超滤至合适体积。以PBS平衡Sephecyic200柱1个柱体积,上样浓缩后的蛋白液,以PBS洗脱,流速1mLmin,收集洗脱峰。11215细胞病变抑制法测干扰素抗病毒活性:采用WISH细胞VSV系统测定7rPoIFN21于16进行一平端一粘端连接,产物转化用常规CaCl2法制备的感受态细胞E.coliBL

9、21,用菌落PCR法初步筛选,即直接挑取微量菌体作为PCR反应的模板。将得到的阳性质粒进行表达,产物用SDS2PAGE蛋白电泳复选。最后对得到的重组质粒测序确认,记为pGEX2IFN。5。2结果211定点突变图2pPGEX2IFN质粒构建示意图Fig.2ConstructionofrecombinantplasmidpPGEX2IFN首轮PCR产物U为279bp,第二轮扩增产物rPoIFN21为570bp,均为单一条带,如图3所示。212表达质粒的构建首先用质粒PCR法初步筛选,得到5个阳性重组子。分别诱导表达后,进行SDS2PAGE蛋白凝胶电泳,有一个重组子表达的产物大小与预期相同。将此重组

10、质粒进行测序,序列与设计的完全一致(结果未显示)。213重组蛋白的表达及包涵体分离如图4所示,诱导后SDS2PAGE电泳图谱上在11213重组菌株的诱导表达:将含pGEX2IFN重组质粒的菌株接种于含氨苄青霉素(50gmL)的2×YTA液体培养基(蛋白胨16gL,酵母提取物10gL,NaCl5gL)中于30震荡培养过夜,次日1:100接种扩大培养,30振荡培养至对数中期,加IPTG至终3期陈涛等:重组猪干扰素基因定点突变及在大肠杆菌中的表达34143kD处出现明显加深条带,约占菌体总蛋白的20%。诱导时间为215h。表达产物主要以包涵体形式存在,经洗涤后可得到纯度高于80%的产物。图

11、5S200快速液相色谱在高浓度盐酸胍中分离纯化复性后的IFNFig.5Sephacryl2S200gelfiltrationofrenaturedIFN倍比稀释,以结晶紫染色显示其抗病毒活性,用酶标图3PCR产物电泳分析图Fig.3ElectrophoresisanalysisofPCRproductM.Maker;11U;21rPoIFN21仪测定540nm的A值,5200IUmg。3HuIFN2同源性最21-99,29-139之间形成2个二硫,其中29-139之间的二硫键对于干扰素的生物7活性更为重要。文献报道,HuIFN2D的第86位多一个Cys,将其改成Asp后,生物学活性有明显提3高

12、。我们在以前的研究中克隆到编码猪型干扰素成熟肽部分的基因片段,在大肠杆菌中进行原核表达,结果其抗病毒活性只有3600IUmg(陈涛等,待发表)。查究其序列,发现其编码的肽段恰在第86位也多出一个Cys,可能影响了干扰素的生物活性。本实验用巨引物PCR法介导的定点突变将其突变为Tyr(以PoIFN21为参照),同时将干扰素成熟肽的第一个氨基酸(Cys)的密码子TGT同义突变大肠杆菌偏爱的密码子TGC,以期提高其活性和表达效率,得到了较满意的结果。所运用的巨引物PCR方法只需设计3条引物,进行两次PCR反应就可在模4板的任意部位引入突变,是一种简单有效的方法。基在构建融合蛋白表达载体时,由于PoI

13、FN2因内部已有一个BamHI酶切位点,故采用一平端一粘端方式连接,以保证阅读框的正确。因S1核酸酶用量较难控制,因而在高倍稀释的S1核酸酶作用后,除用菌落PCR法初步筛选外,还需将得到的质粒表达产物用SDS2PAGE蛋白电泳作复选,排除被切过头的载体,最后对得到的重组质粒测序确认。目的蛋白以包涵体形式表达的一个好处是可以通过洗涤、离心方法将其迅速纯化,但包涵体蛋白需经过变复性处理才能得到有生物活性的蛋白。一般图4重组蛋白表达Fig.4TheexpressionofrecombinantproteinM.Marker;11BL212pGEX2IFNbeforeinduction;21BL212

14、pGEX2IFNaf2terinduction;31Supernatantfractionaftercentrifugationofbrokencellswith17000g;41Pelletfractionaftercentrifugationofbrokencellswith17000g;51Supernatantfractionafterextractingwithsodiumdeoxy2cholate;61Pelletfractionafterextractingwithsodiumdeoxycholate214重组蛋白的变复性处理浓度为115mgmL的重组蛋白在含8molL尿素的变性

15、液中搅拌3h后即变清亮。SDS2PAGE凝胶电泳表明在4molL尿素处开始有目的蛋白条带出现(结果未显示),因而折叠中点约在315molL尿素处。215FPLC纯化见图5。以PBS平衡Sephacryl2S200柱(115×5315cm),上样经PBS透析的复性产物,可看到明显的目的蛋白峰出现,保留时间约为40min。复性后存在于上清中的蛋白基本为活性形式的PoIFN单体分子。216重组蛋白活性鉴定在WISHVSV系统上,采用细胞病变抑制法,用标准干扰素作对照。于96孔板上将两种干扰素均做342生物工程学报18卷用6molL的盐酸胍或8molL的尿素进行变性溶解,然后将变性液直接稀释

16、或透析到较低的变性剂浓度,蛋白质即可在一定程度上自发复性。其中确定蛋白质在多大浓度的变性剂下进行重折叠(即折叠8中点),并以明确方式通过此区域非常重要。本实的折叠中点进行了粗略估算,更验只是对PoIFN2适宜的条件有待进一步摸索。提纯过程中,在包涵体洗涤及变复性初期加入适量PMSF及苯甲酰胺可抑制目的蛋白降解,适量的2巯基乙醇则有助于防止二硫键氧化和减少蛋白间凝聚形成。基因进行有目的的总之,本实验通过对PoIFN2改造,使其得到了较好的表达,经纯化后具有较高的打下了基础。生物活性,为进一步研究利用PoIFN2REFERENCES(参考文献)1LefevreF,BonnardiereCL.Mol

17、ecularcloningandsequencingofageneencodingbiologicallyactiveporcine2Interferon.JInterferonRes,1986,6:3493602CHENT(陈涛),WANGY(王莹),LIZ(李震)etal.StudyingwithallelespecificPCRandsplicingbyoverlapextensionPo2IFNtechnique.ActaAgricultureShanghai(上海农业学报),2001,17(4):18203WANGW(王伟),HOUYD(侯云德).Constructionofanin

18、terfer2onmutant(IFN2186D)anditsbiologicalactivities.ChineseJournalofVirology(病毒学报),1990,6(4):3223254KammannM,LaufsJ,SchellJetal.RapidinsertionalmutagenesisofDNAbypolymerasechainreaction(PCR).NucleicAcidsRes,1989,17(13):54045SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.Molecularcloning:alaborato2rymanual;secondedit

19、ion,coldspringharborlaboratory.ColdSpri2ngHarbor,NY,1989,pp.26276LefevreF,LharidonR,Borras2CuestaFetal.Production,purifi2cationandbiologicalpropertiesofanEscherichiacoli2derivedrecom2binantporcinealphainterferon.JGenVir,1990,71:105710637PestkaS,LangerJAetal.Interferonsandtheiractions.AnnRevBiochem,1

20、987,56:7277778Marshak,KadonagaJTStrategiesforproteinpurifi2cation:ourseManualColdSpringinEscherichiacoliSite2directedTRui2Song2,3LIUHui2Li2,3LIZhen2,3CAOXiang2Rong112(SchoolofLifeScience,NanjingNormalUniversity,Nanjing210097,China)(AnimalHusbandryandVeterinaryResearchInstitute,ShanghaiAcademyofAgric

21、ulturalSciences,Shanghai201106,China)3(ShanghaiKeyLaboratoryofAgriculturalGeneticsandBreeding,Shanghai201106,China)wasmutatedtoTyr(TAC),andthefirstcodeTGTwassimulta2AbstractByusinghugeprimerPCRCys86(TGC)ofPoIFN2neouslychangedtoTGC,whichisabiascodeofE.coli.TheexpressionplasmidpGEX2IFNwasconstructedsuccessfully.,whichisexpessedasinclusionbodies,wasabout20%ofthetotalprotei