纳米羟基磷灰石_胶原材料复合硫酸庆大霉素缓释系统体内释放实验

1、廖红胜等纳米斤基碼灰石/胶原材料复合硫酸庆大奇索缓释系统体内释放实验 823 纳米轻基磷灰石/胶原材料复合硫酸庆大霉素缓释系统体内释放实验廖红胜，刘勇笃杨述华，潘海涛，熊蠡茗，刘佳华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科,武汉430022摘要：目的 制备纳米绘棊磷灰右7胶原材料复合硫酸庆大睑素缓释系(nanTHA/(?(；M-|)l)S) 观察其体内释药 效力.以J求龙好的抗工索缓释系统。方法 制备纳米轻基磷灰石丿胶原材料复介硫酸庆大霉素缓释系统；体内释 放实验:将naiKrHA/G-GM-DDS聚合物植入大鼠股四头肌,术后第1、3、5、7、9、12、18、24天各选6只大亂，取股四头肌 肌肉组

2、织,用标准曲线计算出冬标本药物浓度，用SPSS 12.0统计软件包绘制nan(rHA/GGM-DDS的释药浓度与时间 关系图，光镜下观察肌肉组织的炎性反应。结果 术后第1天肌肉中imiicrHA/C-GM- DOS庆大奇素质量浓度为 (13ft 359.25) mg/ L.其后逐渐下降至术后第24天时肌肉中庆大离素质屋浓度仍可达(5.251, 01) mg/ L.局部组织 中庆大霍索质量浓度仍在金黄色简萄球胡报小抑1%浓度(2 mg/ L)以上。结论nanaH A/ C-GM-DDS在体内有较好的 缓慢释放效应，是一种较好的治疗骨组织感染的生物材料。关键词：药物释放系统；缓禅制剂；纳米疑基磷灰

3、石；胶原材料；付组织感染中图分类号：R681. 2DOI:10. 387(Vj. issn. 1672-0741.2010.06. 021Preparation and Biological Characteristics of Nan| an plastic naixr hydroxyapatitnanr II M c()llagrn( C)gent aink in(GM) drug delivery svs- teni( DDS)( !)an(y H A/ (? (；M DDS)an! ?xplore the efficieixy of iiaixr H A/ G (； M- DDS in

4、 vivo release periment in rats in order to find ideal methods for the management of chronic osteomyelitis. Methods The nanor HA/ G GM* DDS was prepared. Nancr H z / GO M |M)ly in(kr w as impkmlrl in the holes made at (juadrireps frino ris of ex|MKrim(kntal rats through operat ions. Six rats were Bel

5、vearateK aixl |ualr iaeps feinoris w ere obtainel on tliv 1 2imI9 3rl 5t lu 7tlu 9th, 1 2thw IStlu and 24th clay after implantation. SPSS 1 2. 0 statistical soft uarliul in drawing of relationship graph 1x4 w etui lime and drug r(- least? concent ration of naiur II A / G GN卜 DDS after cakulaliiig GM

6、 coiHiHitration of each sampk* l)y standard curve. T Im* inflanr matory response of muscle specimens was observed under the Iight microscopy. Results On t lie 1st clay after op-ration, the GM (xincentrat ion in(jualrre|)s frmoris arouinl naixy H A/C? G DDS w as( 130. 35 9. 25) mg/ L, then a k!crrnit

7、 tendency could be observed,bul on the 24th (lay the GM concentration in quadriceps femoris was(5.25 1.01)mg/L. which still exceeded the minimal inhiliitory concent rat io n( 2 mg/ L) for the staphylococcus aureus. Ginclusion The nancy H A/G GM* DDS has better si on* release! properly ill vivo. s hi

8、cli am be used as an effed ive biologiaal material in tlie inaiiagne tissue in fed ion.Key words drug delivery system; delivery | reparation; naiur hy dmxyapatit e： collagen; Imiim* tissue in fed ion廖红胜等纳米斤基碼灰石/胶原材料复合硫酸庆大奇索缓释系统体内释放实验 823 廖红胜等纳米斤基碼灰石/胶原材料复合硫酸庆大奇索缓释系统体内释放实验 823 nano-尽管冃前手术技术不断提高、抗生素层出

9、不穷. 但如何有效治疗慢性骨舫炎仍然是临床上一个棘手 的问题。H KZ用局部药物缓释系统(dmg delivery system, DDS)聚甲棊内烯酸甲酯庆大得素珠链 治疗骨髓炎以來,DI)S就一克被认为是治疗慢性骨 觸炎的一种有效方法(卜引。聚甲棊内烯酸甲酯珠链 町在局部获得持续的较高药物浓度同时血药浓度廖红胜.男.1981年生硕七研究生 B mail: tjlhs 163. com* 通讯作 者，Corr es|x)n(ling author, E mail: liuyongS melm ai 1. com.保持较低。但是，聚屮妹丙烯酸甲酣珠链不能降解. 需二次手术取出，而且它能被纤维蛋

10、白迅速包裹，为 病原菌提供理想的生存环境。因此近年來可生物 降解的DDS系统成为研究热点，如纤维絮引、胶 原、聚乳酸类、乘组合异种骨等释药系统。但 是,这些DDS系统存佥载药帚:不大、爆释作用明显、 释放时间短、有一定抗原性等缺点。因此，我们研制 r纳米轻某磷灰石/胶原材料复合硫酸庆大壽素缓 释系统(nan(rHA / C-GM-DDS),以期为骨组织感 Pubhs継翻1蜥融疗材料d 01 1994-2011 China Academic Journal Electronic1材料与方法1.1实验材料选择清洁级雄性大眠51只，体重200 g,由华中 科技大学同济医学院实验动物学部提供。纳米疑基

11、 磷灰石(namrHA)及胶原材料(C)由华中科技大学 生物工程与材料学院提供。硫酸庆大霉素(GM. Sigma公司生物制品)o色谱仪:Walers 600E. 2996 PDA, 717 autosampier;色谱柱:Agilent Zorbax C 18 250 mm x 46 nun;流动相,A: H2OHAeMeOH (50： 5： 45);B: Me()H,0 15 min、40% 48% B, 15 15. 01 min、48% 55% B, 15. 01 46 min、 55% B;波长 330 nm;流速 1.0 mL/min;柱温 30C。 1.2 nano HA (；M

12、的制备GM GM溶于水，与naiurHA混合，质量比为 2： 1( (；M : nan(r HA).在超声波中分散20 m in.然 后磁力搅拌7() ho停止搅拌后，将药物和namrHA 的混合液冻干，得白色冻干粉naiurHA-GMo nan(r H A/ GG卜DDS的制备:将白色冻干粉nancr HA-GM,分散于C溶液中，nan(rHAGM与C的 质量比为1: 3;得到nan(rHA/(?GM的聚合物，环 氧乙烷消毒灭菌备用。1.3绘制GM进样蚤总峰面积标准曲线对照品溶液的配制，取(；M对照品适量，精密 称定，配制成浓度为67. 6 mg/mL的对照品溶液。 精密吸取该对照晶溶液4

13、mL f 10 mL容量瓶中, 加入2 mL异内醇，1. 6 mL邻苯二醛试液，用异内 醇定容至10 mL,摇匀，于60*C水浴15 min,冷却, 0. 45 Um滤膜滤过,备用。供试品溶液的配制.楕密 吸取上清0. 9 mL加入0. 5 mL异丙醇,0. 4 mL邻 苯二醛试液，用异丙醇定容为2. 5 in L,摇匀,60 水 浴15 min,冷却,0. 45 Um滤膜滤过，精密吸取20 L进样。精密吸取配制好的庆大霧素对照品溶液 5、1O、15、25、35 UL注入高效液相色谱仪，以进样量 (Ug)为横坐标；硫酸庆大毒素系氨某糖昔类抗生 素，经分离确证含十余种组分，主耍组分为(：、(二、

14、 CC2,因此以总峰而积(Ci、(：h、Cs、a)为纵坐标， 用SPSS 12.0统计软件绘制标准曲线。标准曲线的 作用：得到GM进样M(Mg)与峰而积的关系，其中 纵处标代表峰而积,横处标代表进样最。当未知浓 度的庆大待素样品注入仪席后，液相色谱仪将会产 生信号，即峰而积。将未知浓度庆大祐素样品产生 的峰而积信号代入标准曲线中，通过线性方程，可以 得到注入液相色谱仪未知浓tit(；M的M( Mg),其除 以进悄钾用严)風恕糠醐曲满進為鴻 的浓度，再乘以稀释倍数即得到实验结果。从而绘 制GM释药浓度与时间关系图。1.4体内释放实验1. 4. 1动物实验和标本采集 健康成年雄性大鼠 48只,行体

15、积分数为0. 1的水合氯醛腹腔注射麻醉 (4 mL/ kg),在左股骨上外侧做一长约1. 0 cm fi切 口，小心分离股四头肌,充分止血后，将nantrH A/ C-GM的聚合物包埋于股四头肌下面。分别于1、 3、5、7、9、12、18、24(1 8个时间点各选6只大鼠取 材，麻醉后处死动物，以离植入物两端0.2 cm处为 中心,在中心点两侧共0. 4 cm宽度内，采取股四头 肌标本，共30 mgo1.4.2组织匀浆制作 用PBS浸泡1 h.用匀浆器 将肌肉组织匀浆,4 500 r/min离心5 min。吸取上 清液,用髙效液相色谱仪测定不同时间点局部股四 头肌中的GM浓度。1. 4. 3组

16、织病理切片制作 随机取健康成年雄性 大值3只及按上述方法分别1、3、7(I 3个时间点各 选1只人佩取材，采取股四头肌标本。送病理科做 组织切片，观察大鼠肌肉组织的变化情况。2结果2.1肌肉组织的炎性反应结果术后第1天,镜下见部分横纹肌肌纤维变性，胞 质溶解。肌束之间间隙增宽，间质内可见大量中性 粒细胞浸润(图1A) o术后第3天，镜下见横纹肌肌 纤维结构尚存，肌束间仅见少最淋巴细胞浸润(图 1B)。术后第7天，镜下见横纹肌肌纤维结构尚存. 肌束间未见明显淋巴细胞浸润(图l(：)o2.2 (；M进样昼总峰面积标准曲线以进样量(也)为横坐标，总峰面积(G、C, C/C2)为纵处标绘制标准Illi

17、线，得线性方程为:y= 13 412x- 161 980. r= 0.999 9。见图 2。2.3 nano HA/G GM* DDS释药浓度与时间的关系结果表明,术后第1天离nancr HA / (? G M DDS 0. 2 cm的肌肉中(；M的浓度为(130. 35 9 25) mg/L,其后浓度逐渐下降，到术后第24天，肌 肉组织中的GM浓度为(5. 25 1. 01) mg/L,肌肉 组织中的庆大毒素浓度仍然在金黄色葡舖球菌的最 小抑菌浓度(2 mg/ L)之上。见图3。3讨论由丁感染局部抗生素浓度较低，全身应用抗生 素治疗慢性H髓炎的疗效较差。N 1978年Wahlig 成功研制局

18、部药物缓释系统(DDS)聚屮基丙烯酸屮 824 华中科技大学学报（医学版）2010年12月第39卷第6期 824 华中科技大学学报（医学版）2010年12月第39卷第6期 824 华中科技大学学报（医学版）2010年12月第39卷第6期A：The 1st day after operation：B：The 3rd day after operationiC：The 7th day after operation图1肌肉组织的炎性反应(苏木特伊红染色.X 200)Fig 1 T he inflammatcry response er C, Ikotickers A L, et al. /zi vitro geiila ni icin release from oomm errially available cal ciunr phosph at e lNnta Hubstituh influence of *arriorl)allc antibiot ic mntaining bo nr filler for osta(ll chiloiui anl p*(1 in micrr spheres: their naluation in ail animal osteomyelitis model | .|. Bone Joint Snrg Br. 20()6: 88(