第十六章转基因技术与作物育种

1、第十六章转基因技术与作物育种转基因育种：就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经DNA 重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势：(1)转基因育种技术体系的建立使可利用的基因资源大大拓宽。（没有物种局限性）(2)转基因育种技术为培育高产、优质、高抗，适应各种不良环境条件的优良品种提供了崭新的育种途径。(3)利用转基因育种技术可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择：很强的目的性(4)利用转基因技术可以大大提高选择效

2、率，加快育种进程 。（5）通过转基因的方法，还可将植物作为生物反应器 生产药物等生物制品。第一节作物的转基因技术一、转基因技术的发展现状(一)国际转基因植物研究与现状1.自从 20 世纪 70 年代重组 DNA 技术创建到 1983 年第一株转基因烟草获得以来，至今已有 35 个科 120 种植物转基因获得成功。（植物）2.先后有 30 多个国家批准了 3000 多例田间试验，涉及的植物种类有 40 多种， 2000 年已有 13 个国家种植了商品化的转基因植物。（国家数量）3.1996 年全世界转基因作物种植面积约为 280 万 hm2，1997 年增加到 1100 万 hm2，1998年为

3、 2780 万 hm2， 1999 年增加到 3 990 万 hm2， 2000 年达到 4420 万 hm2。（面积增长）4.1996-2000 年，转基因作物大部分 (85)种植在发达国家，其中美国种植的面积最大，2000 年为 3 030 万 hm2，占全球的 68。其次为加拿大， 2001 年为 320 万 hm2。随着转基因技术的不断完善和普及，发展中国家转基因作物的种植面积也在逐年扩大，所占份额不断增加， 从 1997 年占全球转基因面积的14，到 2000 年占到了 24。其中以阿根廷和中国较多。5.目前所种植的转基因作物主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，其中以转基因大豆的种植面积

4、最大。（不同农作物）6.目标性状：转基因作物的主要目标集中在培育具有抗除草剂特性的农作物优良品种,其次为培育抗虫和毒病新品种上。(二)我国转基因作物研究与利用概况1.我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。2.主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有49 项，包括水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等10 种。4.目前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花(转 Bt 及 Bt+CpTI双价抗虫棉 )、美国 Monsanto 公司开发的 Bt 抗虫棉，延迟成熟期的转基因番茄，

5、抗黄瓜花叶病毒 (CMV)转基因番茄，抗 CMV 转基因甜椒及转查尔酮合酶 (CHS)反义 RNA 基因矮牵牛。二、转基因育种的程序利用转基因技术进行作物育种的基本过程可分为： 目的基因或 DNA 的获得；含有目的基因或者 DNA 的重组质粒的构建；受体材料的选择和再生系统的建立；转基因方法的确定和外源基因的转化；转化体的筛选和鉴定；转基因植株的育种利用。(一)目的基因的获得目的基因的获得是利用作物转基因育种的第一步。根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物蛋白进行基因克隆；从基因组DNA 或 mRNA 序列克隆基因。1根据基因表达的产物 蛋白进行基因克隆根据基因表达的产物进行

6、基因克隆的主要步骤如下：首先，分离和纯化控制目的性状的蛋白质或者多肽，并进行氨基酸序列分析；然后，根据所得氨基酸序列推导相应的核苷酸序列；采用化学合成的方式合成该基因；最后，通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。（有很大的局限性）。2从基因组 DNA 或 mRNA 序列克隆基因随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的问世及其在基因工程中的广泛应用，已经大大地加快了基因克隆步伐。此外，多种生物基因组序列计划的相继实施和完成，大规模 EST数据库的建立，也使得大规模进行基因克隆成为可能。(1) 同源序列法。同源序列法是根据。(2)表达序列标签：表达序列标签主要是通过基因克隆的基本

7、过程为利用已标记的特异探针进行cDNA的途径获得。利用表达序列标签法进行cDNA 文库筛选，结合巢式PCR和 5'、3'-RACE，得到 5'端和 3'端部分序列直至获得全长的目的基因。(3) 根据连锁图谱克隆目的基因。图位克隆(4) 转座子标签法。(5)差异显示法。(二)目的基因重组质粒的构建(三)受体材料的选择受体是指用于接受外源DNA 的转化材料。能否建立稳定、高效、易于再生的受体系统是植物转基因操作的关键技术之一。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件： 高效稳定的再生能力； 受体材料要有较高的遗传稳定性； 具有稳定的外植体来源， 即用于转化的受体要易

8、于得到而且可以大量供应； 对筛选剂敏感，即当转化体筛选培养基中筛选剂浓度达到一定值时，能够抑制非转化植株细胞的生长、发育和分化，而转化细胞、植株能正常生长、发育和分化形成完整的植株。常用的受体材料有以下几大类型。1愈伤组织再生系统 外植体材料来源广泛，繁殖迅速，易于接受外源基因，并且转化效率高的优点；缺点是转化的外源基因遗传稳定性差，容易出现嵌合体。2直接分化再生系统 此类再生系统的优点是获得再生系统的周期短、操作简单，体细胞变异小，并且能够保持受体材料的遗传稳定性。3原生质体再生系统 优点是能够直接高效、广泛地摄取外源 DNA或遗传物质，可以获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，

9、并适用于多种转化系统；缺点是不易制备、再生困难和变异程度高等。4胚状体再生系统胚状体作为外源基因转化的受体具有个体数目巨大、同质性好，接受外源基因的能力强，转基因植株嵌合体少，易于培养、再生等优点。5生殖细胞受体系统 目前主要从两个途径利用生殖细胞进行基因转化：一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。(四)转基因方法的确定和外源基因的转化概括起来说主要有两类。第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的 DNA 的直接转化。1载体介导转移系统载体法是

10、目前为止最常见的一类转基因方法。(1)叶盘法。(2) 真空渗入法。(3)原生质体共培养法。2外源基因直接导入法(1) 化学刺激法。化学刺激法是借助于聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯醇 (PVA) (2)基因枪轰击法。 (3)高压电穿孔法。又称为电击法。 (4) 微注射法。 (5)其他直接转化方法。如超声波介导法、脉冲电泳法和离子束介导等(五)转化体的筛选和鉴定1转化体的筛选为了有效地选择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择标记基因进行标记。常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因两大类，如卡那霉素抗性基因 NPT 和潮霉素抗性基因 hpt ，除草剂抗性基因 bar 基因等。2转化体

11、的鉴定(1)DNA 水平的鉴定常用的检测方法主要有特异性PCR检测和 Southern 杂交。(2)转录水平的鉴定。常用的方法主要有(3)翻译水平的鉴定。最主要的方法是Northern 杂交和 Western 杂交。RT-PCR检测。(六)转化体的安全性评价和育种利用因而，通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种(系 )，一般在获得转化体后，应结合利用杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。第二节转基因作物的遗传特点1.外源目的基因在许多转化体中都能够稳定整合、正常表达，表现出经典的孟德尔遗传规律。2.但是，随着转基因应用实践的增多，越来越多的实验发现，外源基因在受体

12、中的命运受到一系列生理生化过程的作用并以复杂的遗传方式表现出来。这主要是由于外源基因进入宿主细胞后，将会受到宿主基因组的监控，一般要发生 DNA 片段丢失、重排、异常重组，加之外源基因在宿主基因组内整合的随机性和多拷贝的影响，使外源基因在转基因植株后代中的遗传规律变得非常复杂，对其了解还处于初始阶段。一、外源基因整合的机制从现有研究结果来看，外源基因主要是通过同源重组、位点特异性重组、转座作用和异常重组几种整合方式进入受体基因组。(一)同源重组整合同源重组是外源 DNA与受体细胞染色体 DNA 上的同源序列之间发生交换替代，并整合到受体染色体组上的一种重组方式。(二)位点特异性重组位点特异性重

13、组发生在两条 DNA 的特异位点上，在位点特异性重组酶的作用下，通过对 DNA 的特异性切割实现外源基因的整合。 例如入噬菌体 DNA 通过其 attp 位点和大肠杆菌 DNA 的 attB 之间的位点特异性重组而实现整合过程。(三)转座作用目前比较成熟的有来自玉米的 Ac-Ds系统等。利用转座系统进行基因转移的基本原理是通过体外重组将外源基因插入到上述转座子系统， 在上述携带有目的 DNA片段的重组转座成分复制并整合插入到染色体其他区域时实现外源基因的转移。(四)异常重组异常重组整合是外源基因整合到植物基因组的最常见方式。一般认为异常重组不需要有 DNA 的同源序列、 RecA蛋 白质，以及

14、转座酶的参与。二、整合后的外源基因在植株体内的表现1.通过各种途径整合进入植物基因组的外源基因中只有很少一部分能够整合到基因组，而能够稳定遗传的外源基因所占比例更是非常小。这主要是由于在转基因后代中大多数外源基因都已经丢失或者发生基因沉默(gene silence)所导致的。2.导致转基因沉默的原因是十分复杂的，从现有的研究结果来看按照整合方式和整合的拷贝数来分主要包括顺式失活、反式失活和共抑制三种形式。顺式失活是因为多拷贝的外源基因连在一起，发生甲基化作用而失活；反式失活是顺式失活的一种复杂形式，顺式失活的转基因作为一个 “沉默因子 ”而影响染色体上等位或非等位的基因甲基化，导致基因失活，而

15、沉默因子本身不发生变化；共抑制发生在转基因和内源同源基因之间或者转基因纯合体两个位点之间的相互作用从而导致基因沉默。3.人们先后采用了多种方法克服基因沉默问题，其中最经典的方式有去甲基化、降低拷贝数、添加增强子以及对外源基因的结构进行改造等方法。现有研究结果表明，重复序列是引起基因沉默的关键，因此如何降低外源基因在植物体内整合的拷贝数是解决基因沉默的有效方式之一。4.这可以通过两条途径进行：一是在转基因植株后代中选择单拷贝植株；二是选用外源基因整合拷贝数低的转基因方法。三、外源基因在后代中的遗传规律转基因植物的基因分离与经典的遗传分离是不同的。在经典遗传理论中遗传分离是统一的，等位基因分离将会

16、导致性状分离，遗传方式相对简单。（无规律性）可能的原因有：外源基因的重排或者缺失，外源基因导入诱发的隐性致死突变或转基因纯合致死，含转基因的雄配子致死、非转化体在早代逃避选择等。进一步研究表明，转基因分离方式的多样性与转基因的整合方式和拷贝数有关。多拷贝整合是常见的整合方式，在某些转化事件中，转基因的拷贝数达到几十个，它们有的串联整合，有的独立整合，有的串联与独立整合共存。这些转基因拷贝在世代传递中的不稳定性和相互位置的改变以及彼此间直接与 (或)间接的互作，增加了外源基因分离与表达的复杂性。一般来说，农杆菌介导的遗传转化后代多呈简单的孟德尔遗传，而一些直接转化方法，基因枪法获得的转基因后代分

17、离相对复杂一些。第三节转基因作物品种的选育通过转基因技术获得的转化植株很少直接作为品种进行推广应用，这是由于各类作物品种都具有一系列主要育种目标性状，将外源基因导入受体植株只能赋予该株具有特定的目标性状，对于其他目标性状是否符合生产的需要还不清楚。由于转基因目标性状是通过非常规手段方式获得的，外源基因的插入很有可能对原有基因组的结构发生破坏，并对宿主基因的表达产生影响，这势必影响甚至改变该作物品种的原有性状。此外，转基因植物的安全风险性也是一个值得考虑的问题。因此通过转基因方式获得的植株还必须通过常规的品种鉴定途径才能用于生产。从现有转基因育种情况来看，所获得的转基因植物主要用于为培育新的作物

18、品种而创造育种资源。一、转基因作物育种目标的制订1依据市场经济的需要和生产发展前景2依据不同的自然环境、栽培条件，抓主要矛盾3落实具体性状目标例如在当前限制棉花生产的主要矛盾就是棉铃虫的危害。4要考虑品种的搭配5要充分考虑到转基因作物，尤其是外源目的基因对人类健康和环境安全的影响二、转基因方法的确定及转基因植株的获得1.由于不同的转基因方法各有其优缺点，因此在选择具体的方法时应该充分考虑到上述情况。例如，农杆菌介导法对于转化双子叶植物十分有效2.受体品种的选择在转基因育种中是十分重要的。一般来说，如果转化方法可行，那么，受体品种首选生产上正在大面积推广或即将在生产上推广的优良品种。用它们转化而

19、成的转基因植株易于快速地培育出新品种在生产上推广利用。3.不管通过什么方法，都要对获得的转基因植株开展分子与遗传分析，选择单拷贝插入的转基因植株用于新品种的选育。4.在确定具体的转基因方法和候选目的基因之后，就可以对按照具体的方法实行外源目的基因的转移，在进行严格的转基因鉴定之后获得转基因植株直接作为作物的新品种或者是育种新资源。三、转基因作物品种的选育利用遗传转化途径培育的转基因植株从育种角度来看只是产生的一种种质资源。要想在生产上加以利用，必须通过育种家的加工，培育出成型的品种后，才能推广。(一)纯系育种所谓转基因作物选择育种是指在现有转基因群体中，通过个体选择或混合选择等方式选优去劣，育成新品种的方法。1出现变异的原因外源基因的导入、整合和表达，整合的目的基因的分离、一因多效、位置效应以及克隆的体细胞无性系变异等都会引起变异。2选择育种的方法如果转基因植株的株型，农艺性状比较整齐一致，仅有整合的目的基因分离，那么可以采用改良混合选择育种。(二)回交育种