高效液相色谱法

1、1第二十章高效液相色谱法第二十章高效液相色谱法high performance liquid chromatography；HPLC分析化学教研室分析化学教研室2经典液相色谱法为基础，经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。现代液相色谱分析方法。 3与经典液相色谱法相比与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为颗粒极细（一般为10 m以下）、规则均以下）、规则均匀的固定相，匀的固定相，(键合相键合相)传质阻抗小，柱效传质阻抗小，柱效高，分离效率

2、高；高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达检测器最小检测限可达10 9g，而荧光检，而荧光检测器最小检测限可达测器最小检测限可达10 12g。 4与气相色谱法相比与气相色谱法相比不受试样的挥发性和热稳定性的限制，不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要一般在室温条件下进行

3、分离，不需要高柱温。高柱温。 5第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、主要类型一、主要类型四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 分配色谱法（分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SEC）6第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理 一、主要类型一、主要类型四类基本类型色谱法四类基本类型色谱法 分配色谱法（分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（吸附色谱法（adsorption chroma

4、tography）离子交换色谱法（离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（空间排阻色谱法（SEC）化学键合相色谱法化学键合相色谱法7其他色谱类型其他色谱类型亲合色谱法（亲合色谱法（affinity chromatography；AC）手性色谱法（手性色谱法（chiral chromatography；CC）胶束色谱法（胶束色谱法（micellar chromatography；MC）电色谱法（电色谱法（electrochromatography；EC）8二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法，简称以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法键合相色谱法(bon

5、ded phase chromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相能团键合在载体表面所形成的固定相 9优点：优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高择性高正相（正相（normal phasenormal phase，NPNP）和反相）和反相（reversed phasereversed phase，

6、RPRP）键合相色谱法：）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱根据化学键合相与流动相极性的相对强弱10（一）正相键合相色谱法（一）正相键合相色谱法 固定相：极性键合相固定相：极性键合相如氰基（如氰基（CNCN）、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羟基）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶）键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶） 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物极性的分子型化合物如一些在硅

7、胶柱上分离的物质如一些在硅胶柱上分离的物质11正相键合相色谱法正相键合相色谱法分离机制？分离机制？分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解质在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用和定向作用分离选择性：分离选择性：极性强的组分极性强的组分k k大，后洗脱出柱。大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分分k k减小，减小，t tR R 减小。减小。12（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相如十八烷

8、基硅烷（如十八烷基硅烷（C C1818，ODSODS）、辛烷基（）、辛烷基（C C8 8）键）键合硅胶合硅胶 流动相：流动相：水水为基础溶剂，加入一定量与水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂混溶的极性调整剂常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）（还有有机酸、碱及盐等） 13保留机制保留机制疏溶剂理论（疏溶剂理论（solvophobic theory）溶质的保留主要是溶质分溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的子与极性溶剂分子间的排排斥力斥力，促使溶质分子与键，促使溶质分子与键合相的烃基

9、发生合相的烃基发生疏水缔合疏水缔合。不是溶质分子与键合相间不是溶质分子与键合相间的色散力，的色散力，14反相键合相色谱法反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素1 1、溶质的分子结构（极性）、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，极性越弱，疏水性越强，k越大，越大，tR也越大也越大。同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，k越大；越大； 引入极性取代基，降低疏水性，引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。值变小。2 2、固定相、固定相键合烷基的疏水性随键合烷基的疏水性随碳链的延长碳链的延长而增加，溶而增加，溶质的质的k也增大。也增大。硅胶表面硅胶表面键合烷

10、基的浓度越大键合烷基的浓度越大，则溶质的，则溶质的k越大。越大。 15反相键合相色谱法反相键合相色谱法保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素3 3、流动相、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大越大溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使k增大增大中性盐的加入：使中性溶质的中性盐的加入：使中性溶质的k增大增大pH：影响弱酸、弱减的离解：影响弱酸、弱减的离解流动相的流动相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱碱增大；弱碱k变小。变小。16离子抑制色谱法离子抑制色谱

11、法（ion suppression ion suppression chromatographychromatography；ISC ISC ）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的的pHpH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使水缔合作用，使k k变大。变大。适用于适用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱碱的弱碱反相键合相色谱法反相键合相色谱法17把离子对试剂加入到含水流动相中，组把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离分离子在流动相中与离子对试剂的反

12、离子（子（counter ioncounter ion）生成）生成中性离子对中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使增加溶质与非极性固定相的作用，使k k增加，改善分离效果。增加，改善分离效果。 （三）反相离子对色谱法（三）反相离子对色谱法 paired ionchromatography；PIC ion pair chromatography；IPC18反相离子对色谱法反相离子对色谱法离子对模型离子对模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORSO)BH离子对mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABE

13、K流动相流动相通式通式19影响容量因子的因素影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的溶质的k k增大；在一定范围内试剂的浓度升增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的高，溶质的k k增大增大 流动相的流动相的pHpH：有利于组分和离子对试剂离：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的子化时（离子对的形成），组分的k k值最大值最大固定相固定相 、流动相性质（同一般、流动相性质（同一般RP-HPLCRP-HPLC）。）。 20适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。

14、型化合物的混合物。分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（基铵磷酸盐（TBATBA）和溴化十六烷基三甲基铵）和溴化十六烷基三甲基铵（CTABCTAB）等）等分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或分析碱类或带正电荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICBPICB5 5）、正己烷）、正己烷基磺酸钠（基磺酸钠（PICBPICB6 6）、）、 适用范围和离子对试剂的选择适用范围和离子对试剂的选择21第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择固定相应符合下列要求：固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；颗粒细且

15、均匀；传质快；传质快；机械强度高，能耐高压；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。22一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相（一）键合相的种类（一）键合相的种类 非极性键合相非极性键合相 ：非极性烃基，如非极性烃基，如C C1818C C8 8C C1 1与苯基等键合与苯基等键合在硅胶表面；在硅胶表面；用于反相色谱；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的长链烷基可使溶质的k k增大，选择性改善，增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。载样量提高，稳定性更好。23键合相的种类键合相的种类弱极性键合相：弱极性键合相： 醚基和

16、二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱用于反相或正相色谱极性键合相：极性键合相：常用氨基常用氨基氰基键合相（氰乙硅烷基氰基键合相（氰乙硅烷基Si(CHSi(CH2 2) )2 2CN)CN)键合硅胶键合硅胶一般用于正相色谱一般用于正相色谱 特殊用途的键合相特殊用途的键合相24（二）键合相的性质和特点（二）键合相的性质和特点 键合反应键合反应硅氧烷（硅氧烷（SiSiO OSiSiC C）型：氯硅烷与硅）型：氯硅烷与硅胶进行胶进行硅烷化反应硅烷化反应 22SiOHClCH+SiSiSiClH18OR118HC3737RRR1如：如：YWGYWGC C1818H H3737，无定形硅胶

17、，无定形硅胶YWGYWG上键合了上键合了十八硅烷基；十八硅烷基；SpherisorbSpherisorb ODS ODS，球形硅胶，球形硅胶SpherisorbSpherisorb 上键合了上键合了ODSODS。 25键合相的性质和特点键合相的性质和特点键合相的性质键合相的性质含碳量：含碳的百分数含碳量：含碳的百分数 覆盖度覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例面硅醇基总数的比例 封尾（封尾（end-cappingend-capping）：在键合反应后，）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基

18、余硅醇基。 26键合相的特点键合相的特点使用过程中不流失；使用过程中不流失；化学稳定性好；化学稳定性好；适于梯度洗脱；适于梯度洗脱；载样量大载样量大 注意：注意：流动相的流动相的pHpH一般应在一般应在3-83-8，否则会引起硅，否则会引起硅胶溶解；胶溶解；( (也有适用宽也有适用宽pHpH范围的键合相范围的键合相) )。 键合相的性质和特点键合相的性质和特点27二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相 对流动相的要求对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k在在110范围内，范围内，与检测器相适应。例如用

19、紫外检测器时，与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。乙腈等可以降低柱压，提高柱效。 28（一）流动相对分离的影响（一）流动相对分离的影响n由色谱柱（固定相）性能决定，由色谱柱（固定相）性能决定，主要受溶剂种类的影响，主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。受溶剂配比的影响。 2211-4nkkR29（二）流动相的强度和选择性（二）流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强正相色谱：溶剂

20、极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同故选择性不同 混合溶剂（二元或多元流动相）混合溶剂（二元或多元流动相）30三、分离条件的选择三、分离条件的选择 （一）（一）HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论涡流扩散涡流扩散A A=2=2ddp p 球形、小粒度、均匀（球形、小粒度、均匀（RSD5%）固）固定相，匀浆高压填充，以降低定相，匀浆高压填充，以降低A。纵向扩散纵向扩散=2=2DDm m 可以忽略。可以忽略。因为因为D Dl l很小，

21、室温操作，且很小，室温操作，且U大于大于U最佳最佳，31HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论传质阻抗传质阻抗固定相传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略可以忽略 ，因，因df极小极小流动相传质阻抗流动相传质阻抗Cm 要求：要求： dp小，小，Dm大大m2PmmDdC32静态流动相传质阻抗静态流动相传质阻抗 ：由于部分流动相在固定相微孔内的滞留由于部分流动相在固定相微孔内的滞留静态流动相传质阻抗系数静态流动相传质阻抗系数C Csmsm C Csmsm d dp p2 2， C Csmsm 1 1/ /D Dm m，而，而D Dm mTT/ / 要求要求: : 固定相固定相d dp p2 2、 流

22、动相流动相都小都小HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论33H H= =A A+ +C Cm mu u+ +C Csmsmu u 原因：化学键合相，液体流动相原因：化学键合相，液体流动相结果：结果：HPLCHPLC的实验条件应该是：的实验条件应该是：小小粒度、均匀的球形化学键合相；粒度、均匀的球形化学键合相；低低粘度流动相，流速不宜过快；粘度流动相，流速不宜过快；柱温柱温适当。适当。 HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论34（二）正相键合相色谱法的分离条件 固定相固定相极性键合相如氰基、氨基键合相等极性键合相如氰基、氨基键合相等 流动相流动相烷烃加适量极性调节剂烷烃加适量极性调节剂35（

23、三）反相键合相色谱法的分离条件固定相固定相非极性键合相如非极性键合相如ODSODS流动相流动相以水为基础溶剂，加入甲醇、乙以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂腈等极性调节剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂加入加入0.1%1%0.1%1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用余硅醇基的作用 36（四）反相离子对色谱法的分离条件（四）反相离子对色谱法的分离条件 固定相固定相 尽可能选择表面覆盖度高且尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相，疏水性强的非极性键合相，离子对试剂离子对试剂 离子对试剂所带的电荷离子对试剂所带的电荷应与试

24、样离子的电荷相反应与试样离子的电荷相反 流动相流动相pHpH使试样组分与离子对试剂全使试样组分与离子对试剂全部离子化部离子化有机溶剂及其浓度有机溶剂及其浓度 同一般同一般HPLC HPLC 37第三节高效液相色谱仪组成组成输液系统输液系统进样系统进样系统色谱柱系统色谱柱系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 38一、输液系统一、输液系统高压输液泵高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵常用柱塞往复泵双泵：为了克服流量的脉动。双泵：为了克服流量的脉动。 有串联式和并联式有串联式和并联式3940输液系统输液系统输液泵应具备的性能

25、：输液泵应具备的性能：流量精度高且稳定流量精度高且稳定流量范围宽流量范围宽能在高压下连续工作能在高压下连续工作液缸容积小液缸容积小密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 41输液系统输液系统输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气42二、分离和进样系统二、分离和进样系统 进样器进样器进样阀（六通阀）、自动进样装置进样阀（六通阀）、自动进样装置色谱柱（色谱柱（columncolum

26、n） 由柱管和固定相组成由柱管和固定相组成分析柱、制备柱分析柱、制备柱 性能评价性能评价 H H、n n、f fs s、k k和和的重复性，或的重复性，或R R。 4344三、检测系统三、检测系统（一）检测器（一）检测器(detector)(detector)的主要性能的主要性能要求：要求：灵敏度（灵敏度（sensitivitysensitivity）高（检测限低）高（检测限低）噪音（噪音（noisenoise）低）低线性范围（线性范围（linear rangelinear range）宽）宽重复性（重复性（repeatabilityrepeatability）好）好适用范围广（通用型、专属型

27、）适用范围广（通用型、专属型） 45（二）紫外检测器（二）紫外检测器(ultraviolet detector) 检测原理：检测原理：朗伯比尔朗伯比尔 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，响应定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比信号（吸光度）与浓度成正比A=Cl特点：特点：灵敏度较高（灵敏度较高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。坏样品，应用广（分析、制备）。局限：局限：只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截只能检测有紫外吸

28、收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。止波长应小于检测波长。 专属型、浓度型检测器专属型、浓度型检测器46紫外检测器紫外检测器固定波长检测器固定波长检测器 ：254nm254nm可变波长检测器：可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯光源：氘灯（和钨灯），）， 200200400400（800800）nmnm，单色器，流通池（试样），光电，单色器，流通池（试样），光电管管光路系统和紫外分光光度计相似光路系统和紫外分光光度计相似 光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 (photodiode (photodiode array detectorarray detector； PDAD)PDAD)：一系列光电二极管，一系列光电二极管，一个二极管对应接一个二极管对应接受光谱上约受光谱上约1nm1nm谱带宽的单色光谱带宽的单色光 474