石墨烯加速神经干细胞成熟和分化

1、启示神经与基于 BSC疗法的导电材料的接口： 通过偶合石墨烯加速神经干细胞的生物电功能 开发为了管理在组织工程细胞特异性行为神经修复和再生，更好地理解材料-细胞相互作用，尤其是生物电功能的，极其important.Graphene已报道是用作支架的潜在候选和神经interfacingmaterial.However ,石墨烯这些导电性基板细胞膜的生物电演变在很大程度上仍然 没有进行过。在这项研究中，我们使用了神经干细胞（NSQ模型，探讨膜生物电属性 E包括增殖和分化conditions.We下休息膜电位和动作电位E和细胞行为上的石墨烯薄膜中使用的组合可能发生的变化单细胞电生理记录和传统的细胞生

2、物学技术。石墨烯不影响基本膜电参数（电容和输入电阻），但搁在石墨烯衬底细胞膜电位分别更强烈增殖和分化的条件下为负。此外，神经干细胞及其对石墨烯基片表现出的后代与对照相比，在开发过程中增加的动作电位的射击。但是，石墨烯只有轻微影响电动刻画ofmature NSC后代。石墨烯基片上的被动和主动的生物电特性Themodulation伴随着增强NSC分化。此外，棘密度，突触突触蛋白表达和在.Modeling石墨组所有activitywere增加上导电的石墨烯衬底电场表明由该 负电的细胞膜产生的电场大于上即控制它的石墨烯衬底高得多，这可以解释观察到的 通过耦合石墨烯的生物电的发展变化。我们的研究结果表明

3、石墨烯是能够加速在开发过程中的NSC成熟，特别是在生物电发展方面。我们的发现提供对导电材料在调谐膜中的作用的基本理解石墨烯模型中的生物电性能，为未来的发展研究铺平道路方法和材料形成在基于 NSC的治疗的可控通道中的膜性质。石墨烯，碳原子的2维单层，由于材料的独特的电，机械和热特性，一直在纳米技术的最 前沿。它最近被认为是一个有前途的候选人制造超快纳米电子器件，透明电极，纳米复合材料和生物医学材料3。它已经用于多种生物医学应用，包括细胞成像和药物递送4,生物分析5,干细胞研究6,7,甚至光热疗法治疗肿瘤8。最近，我们和其他团体发现使用石墨烯作为神经接口材料的可能性，因为它可以促进人类成神经细胞瘤

4、（SH-SY5Y细胞培养9, PC-12细胞10,海马原代培养神经元11和直 接NSC分化神经元12,13,促进神经干细胞分化成石墨烯纳米网半导体神经元和形成神经元纤维14,15。此外，越来越多的研究表明石墨烯表现出操纵茎的命运的潜在能力细胞。例如，石墨烯基材料能够诱导NSC分化成神经元谱系7,16,控制甚至加速间充质细胞的分化干细胞6,17e22,并调节其他类型的行为干细胞，包括多能干细胞和胚胎干细胞23e25。这些开创性的研究清楚地证明了在细胞治疗中基于石墨烯的材料的巨大潜力。然而，改变细胞行为背后的基础机制，例如增强的分化和促进的细胞增长，仍然很大程度上未知。细胞功能和细胞之间的强连接膜

5、的生物电性质启发我们调查石墨烯是否可以调节NSC发育和成熟的子代通过影响其生物电特性细胞。在这项工作中，我们研究了石墨烯的影响在 NSC发育期间电生理状态的成熟，包括被动和主动生物电特性和随后的NSC命运的选择。2。材料和方法2.1。石墨烯膜制备根据先前公布的 CVD方法26合成石墨烯样品。简言之，将薄铜箔（5cmx 5cm）加热至1000c 并在H 2和Ar气体下退火20分钟，随后暴露于 H 2和CH 4下5分钟。然后在 H 2和Ar气 下将膜从1000 c冷却至室温。通过在硝酸铁水溶液中蚀刻从铜箔上除去石墨烯膜。在铜膜溶解之后，使TCP*板与石墨烯膜接触，并将其从溶液中拉出以制造石墨烯/

6、TCPSg板。石墨烯/ TCPS基底用室安装，并浸没在 milli-Q水中过夜以除去任何残留的可溶性有毒组分。在用75 %的醇灭菌后，石墨烯/ TCPSg板连续浸在无菌 PBS缓冲液中并用PBS中的层粘 连蛋白溶液(20mg / ml, 37c过夜，Sigma, USA)包被。在细胞接种之前，将石墨烯膜在 增殖培养基中浸泡过夜。2.2。 石墨烯基板的表征石墨烯的透射率用 UV / Vis测量光谱仪(LAMBDA 25, PerkinElmer, Singapore)。 玻璃显微 镜将载玻片切成0.9cm 2的矩形。2.6厘米以适应样品架。使用空白载玻片作为参考每次测量。结晶度和层数存在于石墨烯

7、内通过拉曼光谱法检查(lamRAM HR800, HORIBA France)和 TEM (Tecnai G2 F20 STwin FEI USA)。 石墨烯的表面形态 TCPS通过 AFM (Dimension 3100 , Veeco, USA)使用测定在室温下操作的轻敲模式。表面化学的石墨烯膜通过 XPS( AxisUltra DLD, Kratos, UK)与在40eV操作的AlKaX射线源。的通过扫描检查石墨烯膜的形态电子显微镜(SEM) ( Quanta 400FEG, FEI, USA)。2.3。 NSC培养在增殖和分化条件下NSCs来源于海马的两个半球的出生后第1天ICR大鼠(

8、SooChow大学动物中心)。将海马与血管和脑膜分离并在 Falcon管中在Hank平衡盐溶液中收集(HBSS在4C,然后用HBSS 漂洗两次。离心后(1000rpm , 5 分钟)，将组织在 TryplE (LifeTechnologies, USA)在 37 c下孵育15分钟，然后机械地轻轻研磨通过使用移液器吸头。将NSCs1浮于DMEM-F12中含有2%B-27的培养基中，并在潮湿气氛中培养用5% CO 2在37C。进彳T NSCs的传彳t每7天培养。对于增殖研究，NSCs接种浓度为 5 g/ 104细胞/ mL其由补充了 2%B-27的DMEM-F12 培养基组成与 20ng / mL

9、 EGF 和 20ng / mL FGF-2 ( R& D Systems,美国)。 对于 分化研究，NSC以相似的方式接种浓度在含有2%B-27的DMEM-F12培养基中与胎牛血清(GIBCO, USA)和1mM视黄酸(Sigma)。在这些实验中动物的护理和使用遵循由护理和 使用批准的指导方针和协议东南大学动物委员会。所有的努力使所使用的动物数量和他们的痛苦最小化。2.4。 免疫荧光用PBS洗涤细胞，在4%多聚甲醛中固定 45分钟，在含有2%BSA的PBS中封闭，并用透化 0.1%triton X-100, 90分钟。 将细胞与原代培养抗体孵育90分钟，然后与第二抗体温育持续60分钟，然后进

10、行 DAPI染色。抗体小组包括针对 GFAP的一抗，Ki67 (Abcam, USA),Tuj-1, O4,微管蛋白，纽蛋白( Sigma)和 TREK-1 (Santa Cruz Biotechnology,美国)。 对 于成像树突棘，细胞已被转导与编码mCherry-肌动蛋白的慢病毒。pLVX-mCherryactin载体(Clontech, USA)用于包装慢病毒。细胞在 DIV 21成像。2.5。 基于WST的细胞增殖测定WST-8 2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2,4-二磺苯基)-2H-四咏瑜单钠盐 色度测定法根据 Cell Counting K

11、it-8 ( Dojindo , Japan)。简言之，10% (v / v) CCK-8溶液在指定的时间点加入培养基中并在培养箱中孵育细胞4小时。 然后，200mL的最终溶液转移到96孔板中使用酶标仪在波长入下测量吸光度450nm。2.6。 RNA 提取和 RT-PCR进彳t RNA分离，逆转录和 PCR分析按照标准方案进行。简言之，总细胞 RNA使用TRIzol试齐J (Life Technologies) , 1mg RNA分离使用 TaqMan Reverse Transcription Reagents进行逆 转录（Applied Biosystems）,和所示的 mRNA水平使用

12、SYBRGreen主混合物一式三份分析 基因（Applied Biosystems）和 Chromo-4 实时 RT-PCRCZ器（MJ Research）。 将 mRNA 水平 标准化为GAPDH （内部对照）和基因表达呈现为倍数变化（ DDCt法）。2.7。 免疫印迹用在0.03%EDTA中的0.25%胰蛋白酶收获细胞并裂解在RIPA缓冲区。将收集的蛋白质样品装载在10%聚丙烯酰胺凝胶，通过凝胶电泳分离并转移到PVDF膜（Millipore , USA）上。将细胞孵育与针对巢蛋白的多克隆一级抗体（1:400, Sigma） , TREK-1 （ 1:500, Santa CruzBiote

13、chnology）,突触泡蛋白（1:400, Millipore ）或 PSD-95 （1:400, Abcam, USA）和次级 抗体（Santa Cruz Biotechnology）。 然后膜与 ECL western 印迹底物试剂盒（Pierce, USA） 反应曝光。GAPDH用作内部对照。2.8。 电生理记录将补片移液管从硼硅酸盐玻璃毛细管中取出（1.2 / 1.5mm： ID / OD）,并用含有移液管溶液填充 120mM CsCl, 20mM 四乙基氯化镂，2mM MgCl 2 , 10mM EGTA, 2mM ATP 二钠，和 10mM HEPES电阻 3e4 MU。记录溶液

14、由 156mMNaCl , 4mM KCl, 1mM MgCl 2 , 2mM CaCl 2, 10mM HEPES 10mM葡萄糖，pH 7.25 （用KOH调节）。获得常规的全细胞膜片钳记录用Axopatch1-D （ Molecular Devices , USA）。在此期间电压钳位，保持电位设定为？ 64mV。无补偿串联电阻值8e12MU。在此期间电流钳记录，电桥平衡连续监测和调整。密封不良的细胞或 那些丢弃15e30MU范围之外的串联电阻。对于 VR记录，石墨烯和 TCPS上的细胞样品每天 记录。 记录AP至少7分钟后膜破裂。通过具有上升速度来鉴定 AP超过50mV / ms并且根据

15、全或无代。刺激阈值是最低强度刺激所需的诱导AP。这是由200毫秒确定的电流步长（10e150 pA, 10epA增量）。 振幅（从基线到峰值）和持续时间（在 20mV以上测量阈 值）。 检查重复AP点火，一串强度为 40 pA的1 s电流高于刺激阈值，并注射细胞的反应 记录。 对于自发性突触后电流 （sPSC记录，在？ 70mV的保持电位下记录 sPSCt用EPC-9 放大器（HEKA,德国）。所有信号都被数字化在10kHz下，在2kHz下过滤，存储在计算机硬盘上，并用Igor Pro 4.05软件（Wavemetrics,美国）。2.9。 数据分析数据表示为平均值土 SEM。通过分析数据双向

16、或单因素方差分析，然后进行Tukeys事后检验。Ap值小于0.05被认为是显着的。2.10。 讨论3.1。 石墨基板制备石墨烯膜通过化学气相合成沉积（CVD）法26,然后转移到组织培养聚苯乙烯（ TCPS基板（仅TCPS对照底物）。石墨烯膜显示出良好的透光特性（图1A）。 基于对光透射率（在波长处？ 90%的光透射率的500e1000nm）和室温微拉曼光谱的石墨烯薄膜，我们估计石墨烯薄膜包含 3e5层27,这进一步验证通过透射电子显微镜（TEM）图像（图1B）。的石墨烯膜的表面通过SEM （图1E）和原子力显微镜（AFM）成像由许多波纹组成和微米级的皱纹（图1C）。表面通过X射线进一步检查石墨

17、烯膜的化学光电子能谱（XPS）。 。 1D,两个明显的组成部分可以观察到，主峰在284.6 eV对应到非氧化环 C,和反射的小峰在 CeO键中的Co这些结果表明相对惰性的表面化学。在用层粘连蛋白预包被后，据信是可用于NSC附着和生长，石墨烯显示支持NSC增长与单独的TCP涮当的能力（数据不是显示）。此 外，由石墨烯的I-V曲线计算膜的薄层电阻在50mm内为约350U。 50mm尺寸（图1F）,其与报告的薄层电阻相当的石墨烯膜28。3.2。 石墨烯基板上的 NSC生长在使用前通过几种方法检查NSCs自由浮动可以在增殖条件下在DIV5形成神经球（补充图S1A）,其被接受为 NSC的证据存在。此外，

18、对巢蛋白（一种 NSC标记）显示大多数细胞是巢蛋白阳性（补充图。S1B和C）,进一步在本研究中提供NSCs的验证。在增殖或分化下培养几天后条件（见材料与方法部分）的特点的NSCs及其后代，包括粘附，迁移，形态学和生存力，仔细检查了石墨烯基质。接种2e4小时后，细胞粘附石墨烯基板（数据未示出）。一周后播种，SEM显微照片显示石墨烯上的细胞通过广泛铺展和形成表现出健康的粘附强丝状伪足/石墨烯相互作用（补充图S2A）。还有，针对纽蛋白，膜性骨骼的免疫荧光染色蛋白参与粘连，显示丰富在NSCs中的纽蛋白的表达（补充图S2B）,提示细胞在石墨烯膜上的良好粘附。国家统计委员会生长在石墨烯膜上表现出正常的容量

19、早在接种后一天从神经球迁移（补充图S2C。 此外，细胞（特别是神经元）生长在石墨烯基板上显示典型的细胞体形态和大小伴随正常轴突生长和扩展。最后，石墨烯上的细胞活力通过钙黄绿素-AM和EthD-1染色评价底物测定。 补充图S2E显示几乎90%的细胞在石墨烯上培养 7 天是活的，并且没有石墨烯和TCPM间的细胞活力的显着差异在增殖条件下控制7天的培养（补充图S2F）。这些数据证明了好石墨烯作为NSC培养基质的生物相容性生长，这与以前的研究一致7。值得提，我们的研究调查的直接互动的效果在细胞和石墨烯之间。其他研究显示的可能性操纵有效的细胞-细胞和细胞-材料耦合3周神经干细胞29和刺激分化的后显影的非

20、接触电刺激，以控制细胞-细胞使用石墨烯材料30。这些研究可能开放基于石墨烯用于充实细胞耦合的新方法组织工程神经修复和再生。3.3。 细胞在石墨烯上的被动生物电特性基板石墨烯对细胞的最直接和明显的影响应该是在细胞膜上。考虑离子的重要作用用于控制细胞功能的膜中的通道和泵，石墨烯上膜生物电特性的可能变化需要先解决。在这里，我们专注于两者被动和主动电气活动。此外，我们试图阐明发展之间的可能关系NSCs的生物电性能和随后的行为这些细胞通过探索NSCs中的表型变化生长在石墨烯基板上。评彳t NSCs的被动电学性质和活性和他们的后代在石墨烯基板的开发过程中彻底检查各种电 生理参数在增殖和分化条件下。后紧紧地

21、粘附到基底上，对细胞进行处理全细胞膜片钳记录每天。我们测量和量化了被动膜的性质，包括电容，输入电阻（Rin）和静息膜电位（VR）。在电容或Rin之间没有发现显着差异控制和石墨烯组在增殖和分化条件在体外7天（DIV7）（增殖：18.32.6pF 和 24.2 3.4pF; 344.2 22.8 MU362.7 24.8 MU;分别为 n = 60 ,对照 和石墨烯，图。2A）（分化：19.5 1.8pF 和 22.5 2.0pF;260.3 26.3 MU 和 251.3 27.0 MU; 两者n = 60,控制和石墨烯。2B）。在我们的研究中的 NSCs的Rin类似于以前研究中报道的值31,3

22、2。注意Rin在分化条件下比在增殖下更小两组均表现为正常分化NSCs到神经元或神经胶质细胞，因为NSC后代通常具有降低 Rin。这些结果表明石墨烯偶联没有改变细胞膜的电容或Rin。VR作为另一种重要的被动膜生物电参数，进一步分析。VR是相对静态的膜静止细胞的电位并且不同于特异性动态电化学动作电位（AP）,如下所述。这些参数被广泛接受为度的指标细胞发育和健康33。有趣的是，NSCs和他们在石墨烯基底上生长的后代具有VR的值比来自DIV5的对照在增殖下更负条件（两组的n 50,从DIV5至DIV7的p 9, p 0.05）。 NSCsE石墨烯基底下的干度通过western印迹分析检查增殖条件。NS

23、Cs通常在增殖培养中不容易分化介质，并且它们倾向于保持干燥。众所周知不同的细胞类型保持不均匀的VR,所以我们调查生长在石墨烯上的细胞的更负VR是否到期到一些神经干细胞的分化。Western印迹结果显示巢蛋白的表达，神经干细胞标记35从DIV6eDIV7显着下调（图3EeF）,甚至在增殖条件下。很难确定是否在石墨烯基板上产生更负的VR在NSC分化或如果它是石墨烯诱导的NSC分化导致更负面的 VR。但是，我们推测它是在石墨烯偶联时观察到的更负的VR诱导NSC分化，因为没有明显的在石墨烯组中巢蛋白表达的下调DIV5与对照相比，即使 VR更负在DIV5。石墨烯基板上的电 池显示更负的 VR当在分化培养

24、基中生长时比它们在上控制（图4A）。控制和石墨烯之间的差异组在分化时更明显（从DIV3到DIV14）条件下比较差异增殖条件。这些结果表明石墨烯底物可能加速NSCs的生物电成熟术语的 VR在没有实质性变化的情况下测量性能。我们进一步分析了分化的表型变化NSCs在石墨烯基材上。分化7天后，细胞展示细长形细胞与健康神经突生长导致汇合神经网络几乎跨越整个石墨烯表面。免疫染色结果表明石墨烯膜上的NSCs保持了其多能性以分化成所有三种神经亚型（图4B）,包括神经元（Tuj-1沉积细胞），星形胶质细胞（ GFAP阳性细胞）少突胶质细胞（O4-阳性细胞）。如图所示。 4C, NSCs培养在石墨烯上显示出显着更

25、高的百分比Tuj-1沉积细胞与对照组相比，GFAP阳性或O4-阳性细胞在两个实验组之间。这些结果清楚地表明石墨烯基材可以大大增强NSC分化为神经元。接下来，在 NSCs的后代中的VR在它们分化7天后计算。星形胶质细胞和少突胶质细胞不容易在明场下鉴定显微镜，所以他们都包括作为胶质细胞。VR在两者神经元和胶质细胞在石墨烯基板上显着与在对照底物上生长的那些相比更负（图4D;神经元：对石墨烯为？ 61.41.4mV和？ 64.3 1.4mV和控制；胶质细胞：e78.5 2.3 mV和石墨烯和对 照，分别为85.7 2.5 mV。 n 40, p 0.05 ）。 间隔在尖峰序列内两个连续的AP之间增加，

26、并且在尖峰序列方面在石墨烯和对照之间没有显着差异（图6D）。的倒数计算穗间隔以表示瞬时AP发射速率。 图。图6E示出了诱发AP的叠加轨迹从在从中采样的尖峰序列中的稳 态AP细胞生长在石墨烯和 TCPS。尖峰在重复期间展宽射击是神经元中的广泛现象。在我们的实验中，APs表现出持续增加的持续时间两个培养组中的前五个AP,随后是具有稳态持续时间的 AP （图6E）。在这些细胞中，平均值第一 AP的持续时间为2.15 0.09ms （n =18）和2.050.08 ms （n = 16）,稳态持续时间为在对照中为3.120.11ms （n = 18）和3.170.13ms （n = 16）石墨烯。 这

27、些结果表明石墨烯具有加谏牛物电的成熟的能力性状的 NSCsR不同的发育阶段和它在分化成神经元的NSCs已经成熟N后不能影响离子通道3.6。 神经元成熟和功能进一步确认生物电发展的后果对神经元成熟和石墨烯基板上的功能，观察和分析了几个参数，包括脊柱密度，突触蛋白表达和自发性突触后电流（sPSCS ,在分化白文化21天。首先，通过荧光检查脊柱密度显微镜下细胞转染mCherry-肌动蛋白后（图7A）。棘是小膜突起，并作为突触强度的储存位点 51。脊柱密度，如图所示计数每10mm树突的棘突数。脊 柱密度石墨烯组显着高于对照组（图7B）。第二，突触蛋白表达，包括突触泡蛋白和 PSD95,通过蛋白质印迹分

28、析（图7C）。发现两者的相对蛋白表达的突触素和PSD95在石墨烯组较高（图7D）。最后，突触活动，特点是sPSC减功记录在NSC分化的神经元中组 （图7E）。 sPSCS勺外观提供清楚功能性突触形成的证据。统计结果表明石墨烯中 sPSCS勺平均频率和振幅组显着高于对照组（图7F和G,分别）。sPSCs的频率和振幅的增加在石墨烯组中表明存在局部变化石墨烯基板上的前和后突触特征。注意，形成和在石墨烯基材料上神经元网络的再生非常需要它们在神经系统中的应用52。然而，我们没有尝试调查 NSC分化的形成神经元网络在这里，因为这是超越我们目前的研究范围。此外，图1中的突触电流。 7有间接暗示细胞中的健康神

29、经元接触石墨烯基板。3.7。 石墨烯基板上的电场的建模。微环境中的电场可能影响成熟和发展的生物电特性细胞膜。因此，我们假设电场开导电石墨烯基板可能不同于非导电基板控制基板。验证我们的假设，COMSOL多物理场被用来重塑和计算电场分布。考虑表面的对称性基底其中细胞附着和生长，我们比较电场沿着通过单个电池的中心的轴使用一维模型（图8A和B）来获得更好的理解两个底物上的细胞生长。为了简化系统的建模，NSC被认为是是具有 5mm直径和高度的表面带电圆柱体的4mm等于NSC的尺寸。 在NSC的过程中分化，NSCs的VR及其后代转移？ 40mV至？ 80mV, 这也通过我们的研究证实（图 4A）。假设膜的

30、比电容是 1 mF / cm2,膜的表面电荷密度可 以达到计算为Q =C x V，其中Q是表面电荷密度，C是特定面积电容，V是内部和外部之间的电位膜。因此表面电荷密度转变？ 4 10 -4 C / m 2至？ 10 -4 C / m2。在。之间圆柱体和基底，有一层介 电介质具有a相对介电常数为 2.15e,等于各层聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白（LN）用 椭偏仪测量的 NSC培养中的底物（M-2000DI, J.A.Wo011am Co., USA）。介电常数培养基为 ? 80 （类似于间质液体），并且在衬底的中心的电位为零（用PLO-LN涂覆的石墨烯）。我们首先模拟表面的电场使用仅一个细胞坐标的情况来定位细胞点（0,0）,其是表面的中心，具有密度的表面电荷 ？ 10 -4 C / m 2。图。图8A和B示出了差值电场线的分布导致 的差异基底的导电性。电场线，表示电场的取向和强度是垂直的到表面，它们延伸远离中心导电石墨烯基板（图 8A）。相比之下，电