基因重组Echistatin发酵工艺的优化

1、基因重组Echistatin发酵工艺的优化*中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):6669杨利军杨涛解军赵志强牛勃*（山西医科大学生物化学与分子生物学教研室太原030001）摘要目的：利用基因工程方法对一种蛇毒锯鳞蝰素蛋白的发酵纯化工艺进行优化，以提高目的蛋白的产量和纯度。方法：对工程菌进行发酵培养并诱导表达，研究不同的培养基、不同补料方式、溶解氧浓度、培养和诱导时间对工程菌产量和目的蛋白表达量的影响，利用几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白，通过合适温度和pH裂解融合蛋白得到Ecs纯品，并鉴定和检测Ecs活性。结果：经过高密度发酵优化后，菌体湿重可达

2、110 g/L，目的蛋白表达量约占总蛋白的40%；亲和层析纯化后，得到Ecs单体，得率为68 mg/L发酵液。生物学活性分析显示，重组Ecs能有效抑制血小板的聚集，其活性与天然Ecs相似。结论：通过发酵和纯化工艺优化，大大提高了目的蛋白产量，为进一步规模化研究和生产奠定了基础。关键词蛇毒锯鳞蝰素大肠杆菌发酵纯化收稿日期：20050718修回日期：20050921* 山西省自然科学基金资助项目(20021100),山西省留学归国人员基金资助项目(200159)* 通讯作者，电子信箱：niub2004蛇毒锯鳞蝰素(echistatin, Ecs)是一种从蛇毒中提取出来的活性蛋白，由49个氨基酸残基

3、组成，分子量5 400 kDa，等电点8.3，分子内富含半胱氨酸(8个)，形成4个二硫键(211，732，837，2039)，第2426位是RGD (ArgGlyAsp)，该序列在许多细胞外基质蛋白分子内广泛存在，可以被细胞表面的多种整合素(integrin)受体分子识别结合。因此，Ecs可以竞争性抑制多种整合素分子与其配体的结合，从而抑制活化血小板和纤维蛋白原的结合，具有抑制血管平滑肌细胞迁移和增生的功能，在预防和治疗动脉栓塞及动脉硬化性疾病方面有良好的应用前景14。为了解决Ecs来源困难的问题，近年来，我们利用基因工程的方法制备Ecs，由于Ecs分子量小，单独表达存在一定困难，后来我们采取

4、融合表达方式，构建了Ecs融合表达体系BL21/pTWINEcs，实现了Ecs融合蛋白的高效表达及工程菌高密度发酵培养条件的优化。1材料与方法1.1材料工程菌BL21/pTWINEcs由本室构建并保存；胰蛋白胨、酵母提取物购自Merck KgaA公司；几丁质亲和填料购自NEB公司；其它试剂均为国产分析纯；Biostat5L 发酵罐购自德国B.Braun公司；电泳图像分析系统购自Alpha Innotech公司；层析工作站购自Pharmacia公司；PACKS4型血小板聚集仪购自Helena公司。LB，SOB，2×YT及M9培养基 (Amp100 g/ml，pH 7.4)见文献5；补料

5、I：500 ml (含酵母提取物100g，MgSO4 5g，NaCl 10g)；补料II：50%甘油400 ml；补料III：10%氨水200 ml；补料IV：消泡剂10 ml。1.2菌体密度及菌体湿重测定752紫外光栅分光光度计测定600 nm处菌液的A600值；用分析天平称量菌体湿重。1.3目的蛋白表达水平检测12% SDSPAGE、常规染色、脱色，经电泳图像分析系统扫描得到目的蛋白占全部可溶性菌体蛋白的百分含量。1.4一级种子培养划线接种甘油菌于LB平板，37培养过夜，挑单克隆接种于2ml LB (Amp 100 g/ml)中，37振荡培养过夜，按1:50扩种至50 ml LB (Amp

6、 100 g/ml)中，37振荡培养10 h，培养液即为一级种子液。1.5二级种子培养将一级种子液按4%比例接种至200 ml LB中，37振荡培养10 h，培养液即为二级种子液。1.6发酵培养5L发酵罐装料3L，依次分别改变培养基种类(LB,SOB,2×YT,M9)、补料方式(诱导前一次补料、分批补料、诱导后一次补料)、溶解氧浓度、培养时间(IPTG终浓度为0.08 mmol/L)及诱导时间等参数，观测细菌生长情况和蛋白质表达量，发酵具体操作按照说明书所述进行。1.7融合蛋白纯化及裂解离心收集菌体沉淀，取20 g用TE按110重悬，冰浴超声破菌，18 000 g离心25 min，收

7、集上清，0.45m滤膜过滤。几丁质亲和填料装柱，用平衡液(20 mmol/L TrisCl，0.5 mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH 8.5)平衡20个柱体积(CV)；用平衡液110稀释过滤后超声上清，上样，收集穿过峰行SDSPAGE分析。上样完毕，用含1 mol/L NaCl的平衡液至少洗涤20个CV(以上操作全部在4进行)。用3个CV含3050 mmol/L DTT的裂解液(pH 7.0)以58 ml/min的流速过柱，此过程在30 min内完成，用柱帽封口，25放置3040 h。次日用平衡液洗柱，分别收集3个CV的洗脱峰，18% SDSPAGE鉴定。用G25除去粗样品

8、中的盐和DTT，得到精样品。2005, 25(12)杨利军 等： 基因重组Echistatin发酵工艺的优化中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.12 20051.8纯化产物的鉴定采用18% SDSPAGE，考马斯亮蓝染色。1.9Ecs抗血小板聚集实验健康志愿者静脉采血20 ml，制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整PRP，使血小板数约为250×109/L。取400l调整后的PRP于测试杯中，分为阴性对照组、测试组和阳性对照组，分别加入0.9%NaCl、纯化Ecs和天然Ecs各50l。磁珠搅拌37温育2min，每管加

9、入0.2mmol/L诱聚剂ADP 50l，用比浊法测定血小板聚集率，测定时间为5min。记录聚集曲线，按下式计算血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率=阴性管血小板最大聚集率测试管血小板最大聚集率阴性管血小板最大聚集率×100%2结果2.1发酵培养基和培养时间选择使用2×YT培养基发酵，菌体湿重和目的蛋白表达量都明显优于其它三种培养基(表1)，故确定2×YT作为发酵用培养基。随后，控制细菌培养时间，使其菌密度A600分别等于0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0时进行诱导。当A600为5.08.0时开始诱导，菌体得率和目的蛋白表

10、达量都较高。表1Ecs融合基因工程菌在不同培养基中发酵结果Table 1Results of Ecs fusion protein bacterialstrain in different medium培养基Ecs融合蛋白表达量(%)菌体湿重(g/L)LB12.629.9SOB13.330.62×YT30.650.3M98.915.62.2补料方式的确定通过比较三种补料方式，分批补料效果最佳，菌体得率和蛋白表达量远远高于其他两种补料方式(表2)。表2Ecs融合基因工程菌不同补料方式发酵结果Table 2Results of Ecs fusion protein bacterial s

11、trainin different feeding method补料方式Ecs融合蛋白表达量(%)菌体湿重(g/L)诱导前一次补料11.733.1分批补料36.261.8诱导后一次补料20.553.22.3溶解氧浓度的选择设置5次发酵，分别将溶解氧浓度设定在20%、40%、60%、80%、100%，观测其菌体得率和蛋白表达量，发现将溶解氧控制在60%80%时，菌体得率和蛋白表达量最佳(表3)。 表3不同溶解氧浓度下Ecs融合基因工程菌发酵情况Table 3Results of Ecs fusion protein bacterialstrain in different dissolved o

12、xygen溶解氧浓度Ecs融合蛋白表达量(%)菌体湿重(g/L)20%12.130.240%22.650.460%38.568.680%39.286.9100%26.371.42.4诱导时间的确定加入IPTG诱导后，每隔1 h取样，做全菌蛋白SDSPAGE分析。诱导5 h后，融合蛋白的表达趋于稳定，表达量占到菌体总蛋白的40%左右，相对分子量约为32 kDa(图1)。图1不同诱导时间的SDSPAGE图谱1: 诱导前; 2: 诱导1h; 3: 诱导2h; 4:诱导3h; 5: 诱导4h; 6:诱导5h; 7: 诱导6h; 8:蛋白质分子量标准Fig. 1SDSPAGE of expressed

13、fusion protein Ecs atdifferent induction time1: Before induction; 2: 1 h; 3: 2 h; 4: 3 h; 5: 4 h; 6: 5h; 7: 6 h; 8: Protein Marker2.5Ecs工程菌的高密度发酵根据以上优化条件，用2×YT培养基，37培养6 h左右，IPTG诱导5 h，控制溶解氧浓度为60%80%，补加10%氨水以保持pH恒定。经12% SDSPAGE电泳图像分析系统扫描分析，目的蛋白表达量占全菌总蛋白的40%(图2)，菌体湿重为110 g/L。图2Ecs工程菌发酵的SDSPAGE分析1:

14、诱导前; 25: 诱导后; 6: 蛋白质分子量标准Fig. 2SDSPAGE analysis of Ecs bacterialstrain fermentation1: Before induction; 25: After induction; 6: Protein Marker2.6纯化超声上清过几丁质亲和柱后，Ecs单体从融合蛋白上裂解下来，用平衡液洗脱，收集第1到第3个CV的洗脱峰，经18% SDSPAGE分析，考马斯亮蓝染色呈单一条带，Ecs单体主要存在于第一个洗脱峰中(图3)，得率约68mg/L发酵液。图3Ecs纯化的SDSPAGE分析1:DTT裂解后洗脱峰; 2:胰岛素; 3:

15、蛋白质分子量标准; 4:NaOH洗脱峰5:DTT裂解前穿过峰; 6:上样前样品Fig. 3SDSPAGE analysis of Ecs purification1: Elution CV before DTT cleavage; 2: Insulin Marker; 3: Protein Marker; 4: NaOH elution CV; 5: Penetration peak after DTT cleavage; 6: Sample before loading2.7活性检测表4结果显示，重组Ecs能够抑制ADP活化的人血小板的聚集，且抑制作用与天然Ecs的活性相似。表4Ecs抑制血

16、小板聚集的活性检测Tab 4Bioactivity of Ecs on inhibition of platelet aggregation样品(n=6)阴性对照重组Ecs (100nmol/L)阳性对照 (100nmol/L)血小板聚集抑制率(%)073.6±2.3575.1±1.963讨论工程菌发酵是一个很复杂的过程，要通过优化培养基、补料方式、最佳诱导时机、温度6等来实现工程菌的高密度发酵。当用摇瓶培养时，得菌率一般在10 g/L以下；而优化后的发酵可获得110 g/L的湿菌，同时表达量得到了提高，真正实现了工程菌的高密度发酵。发酵结果表明用2×YT培养基的

17、发酵效果要优于其它培养基，可能和2×YT中营养成分含量较高有一定关系。补料分批培养效果也明显优于一次补料，这是由于在高密度发酵培养时，由于细菌生长过快，相对固定的培养基成分不足以维持其生长的需要，同时由于大量代谢产物的增加，细菌生长的内环境会发生变化，需要不断加入缓冲液及碳源、氮源以维持其pH值的稳定7,8。在进入对数生长期后，随着代谢产物的增多，溶液pH值会下降，当降至7以下时，需加入氨水。加氨水时要点滴加入，根据经验，每加一滴，pH值就会升高0.01，因此切不可流速过快，流量过多。因此，只要创造条件实现工程菌的良好生长和高效表达，就可以实现工程菌的高密度发酵。由于选择了含有蛋白质

18、剪切元件intein(内蛋白子)的pTWIN与Ecs基因融合表达，该体系在25、pH 7.0的环境下具有自我剪切功能，因此在intein与Ecs连接处可实现精确剪切，当Ecs被释出后，融合蛋白前体(intein)仍结合于柱上，从而实现了一步层析法纯化Ecs的目的，极大地方便了外源蛋白的纯化。参考文献1 WierzbickaPatynowski I, Niewiarowski S, Marcinkiewicz C, et al. Structural requirements of echistatin for the recognition of alpha(v)beta(3) and alp

19、ha(5)beta(1) integrins. J Biol Chem, 1999, 274(53): 37809378142 Belisario M A, Tafuri S, Domenico C, et al. Immobilised echistatin promotes platelet adhesion and protein tyrosine phosphorylation. Biochim Biophys Acta, 2000, 1497(2): 2272363 Della M R, Squillacioti C, Garbi C, et al. Echistatin inhib

20、its pp125FAK autophosphorylation, paxillin phosphorylation and pp125FAKpaxillin interaction in fibronectinadherent melanoma cells. Eur J Biochem, 2000, 267(16):504750544 Dolce C, Vakani A, Archer L, et al. Effects of echistatin and an RGD peptide on orthodontic tooth movement. J Dent Res, 2003, 82(9

21、):6826865 Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Labroratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Laboratory Press, 1989. 16696 张怀, 袁其朋, 朱亚平, 等. 人Hepcidin融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达. 中国生物工程杂志, 2005,25(3):4448Zhang H, Yuan Q P, Zhu Y P, et al. China Biotechnology,2005,25(3):44487 Makrides

22、 S C. Strategies for achieving highlevel expression of genes in Escherichia coli. Microbiological Review, 1996, 60(3):5125388 Lee S Y. High celldensity culture of Escherichia coli. Trends Biotechnol, 1996, 14(3): 98105Optimization of Highdensity Fermentation of Recombinant EchistatinYANG LijunYANG T

23、aoXIE JunZHAO ZhiqiangNIU Bo(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Shanxi Medical UniversityTaiyuan030001, China)AbstractObjective：To improve the productivity and purity of Echistatin protein expressed in E.coli by optimizing the fermentation process. Methods：The recombinant bacteria wer

24、e cultured by fermentation and IPTG induction. The fermentation parameters were analyzed by observing the influence on recombinant protein expression and cell growth with the change of medium, feeding method, dissolved oxygen, culture and induction time. The fusion protein was purified by chitin affinity chroma