药物配体与生物大分子受体相互作用核磁共振的研究进展

1、评述与进展药物配体与生物大分子受体相互作用核磁共振的研究进展纪竹生 1,2 刘买利 2 胡继明 311(武汉大学分析测试中心 , 武汉 2(摘 要 , 。 如何 , 是制药工业普遍关注的问题 。 核磁 。检测小分子配体信号在作用 , 是核磁共振进行药物筛选的主要方法之一 。 本文介绍了近年来这方面的研究 进展 。关键词 核磁共振 , 药物筛选 , 评述 2002212222收稿 ;2003205226接受本文系中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子物理国家重点实验室资助课题 (No. 9915081 引 言大多数药物分子均通过与生物体内的大分子 (如蛋白质 结合起作用 。因而要得到一个具

2、有良好 生物利用度 (bio 2availability 、 代谢稳定性和低毒性的药物 , 首先必须寻找到和生物靶分子高度亲和性 和选择性结合的分子 (通常称为先导化合物 ,lead compound 。 为了能快速地寻找到这种分子 , 近 20年 来人们研究了许多方法 。 这些方法主要涉及两个过程 :即寻找先导化合物 , 然后对其进行优化 1。前 一过程涉及到与靶分子相互作用且能抑制其体外活性的药物分子的识别 , 后一过程则是根据体外活性 、 生物利用度 、 药理和毒理性质对潜在药物进行优化 。在以结构为基础的药物设计过程中 , 核磁共振 (NMR 方法被典型地用于先导化合物的优化 , 该研

3、究包括蛋白质或蛋白质 2配体络合物的溶液结构测 定和用同位素编辑 /滤波或核 Overhauser 效应 (nuclear Overhauser effect , NOE 技术迅速测定在蛋白 2配体络合物中配体的结构 2。最近 , 人们发现 NMR 也可以用于药物发现过程中寻找先导化合物 3。 在该应用中 , 核磁共振被用于快速 、 高效地测定分子间的相互作用 , 在原子水平上获得信息 , 指导以结构 为基础的药物设计 。在配体与受体发生作用时 , 许多 NMR 参数将发生变化 , 这就是 NMR 能用于药物筛选的主要原 因 。 NMR 可用多种方法测定药物和蛋白的相互作用 , 如化学位移变化

4、 、 线宽变化 、 转移 NOE 及脉冲梯 度场实验 (pulsed 2field gradient , PF G 等 411。这些方法可以分为检测蛋白信号和检测配体信号 。前一类型的主要代表为 SAR by NMR (structure activity relationship by NMR 12, 该方法需要知道靶蛋白确切的三维结构 , 同时还必须有足够量的 15N 标记的靶蛋白 , 因此具有一定的局限性 。后一类型则采用脉 冲梯度扩散测量 、 转移 NOE 或 NMR 线加宽来检测小分子配体信号 。与观测蛋白信号相比 , 观测配体 信号有很多优点 , 同时观测混合物中所有小分子信号有助

5、于识别与靶蛋白结合的特定成分而无须去卷 积 。 更重要的是 , 直接观测配体 , 排除了对蛋白进行同位素标记的需要 , 因而允许目标蛋白有较大的分 子量 。 正是这两点限制了 SAR by NMR 的应用 。 本文将介绍这些技术的近期发展 。2 亲和磁共振 (aff inity NMR亲和磁共振是近年来出现的一种研究受体 2配体相互作用的方法 13, 它将与特殊受体有结合作用 第 32卷2004年 11月 分析化学 (FENXI HUAXU E 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 11期 14211425的活性配体从与非活性化合物组成的

6、混合物中识别出来 。 由于亲和磁共振不需要对混合物进行物理分 离 , 也不需要去卷积步骤 , 因此它能提高药物筛选的效率和准确性 。亲和磁共振方法的基本前提是 :当 配体与受体结合时 , 该低分子量配体的扩散速率发生明显的变化 , 其结果是结合和非结合配体的扩散系 数明显不同 , 从而允许采用 PF G 实验 14,15从该配体和众多与靶蛋白无结合作用的分子的混合物中对 该配体进行识别 。PF G 实验常用于测定分子的扩散系数 , 该实验常用的两个脉冲序列为纵向涡流延迟 (longitudinal eddy 2current delay , L ED 16和双极性脉冲纵向涡流延迟 (bipol

7、ar pulse longitudinal eddy 2delay , BPP 2L ED 17。 通过增加梯度强度或持续时间 ,L ED 和 BPP 2L ED 序列可以扩展为多维形式 , 其中一个轴表 示的是扩散系数 。 这两个序列也可以和传统的多维 NMR 实验相结合 , 。 简而言之 , 结合 PF G 2spectroscopy , DOSY 18。 由于 DOSY NMR 信号 , 且非常方便和无破坏性 , 20及测定络合常 数 21的常用工具 , 22, 23。 然而 , 如果两个不同化合 , 则处理扩散系数的拉普拉斯变换将不能分辨来自 24。 由于用于高速筛选或来自组合化学合成

8、 的混合物常常由结构相似的分子组成 , 所以上述问题是 DOSY 方法的一个很大缺陷 , 近年来 , 人们开发 出了许多减少化学位移重叠的 DOSY 实验方法 。Wu 等 24提出了一系列结合 L ED 序列和极化转移增强不灵敏核 (insensitive nuclei enhanced by polarization transfer , IN EPT 或无畸变的极化转移增强 (distortionless enhancement by polarization trans 2fer , DEPT 的 DOSY 实验 , 利用 13C 核比 1H 核宽得多的化学位移范围 , 并对 CH 、

9、CH 2、 CH 3基团进行谱 编辑 , 获得了更多的结构信息 , 减少了峰重叠的可能性 。NOE 相关谱 (NOE spectroscopy , NOESY 和全相关谱 (total correlation spectroscopy , TOCSY 是解 析分子结构的常用二维 NMR 谱 , 克服谱重叠的另一种方法就是将 L ED 或 BPP 2L ED 序列和这些传统 的二维实验相结合 , 如 G ozansky 等提出的 DOSY 2NOESY 25或 Lin 提出的 DOSY 2TOCSY 26, 这里 DOSY 2TOCSY 又称为扩散编码谱 (diffusion 2encoded

10、spectroscopy , DECODES 。除增加了梯度脉冲以 外 , 这些谱的脉冲序列与对应的二维相关谱很相似 。 然而 , 由于脉冲梯度场的应用 , 谱中每一个交叉峰 的强度依赖于产生该交叉峰的化合物的扩散速率 , 通过增加梯度脉冲强度而得到的一系列二维谱可估 计某一化合物的扩散系数 , 若不考虑实验误差 , 从某一化合物产生的信号应该获得相同的扩散系数 。 DECODES 实验的优势是把一个 J 2耦合体系的所有 1H 共振都关联起来 , 从而允许探讨重叠共振和完全 分辨共振的相关情况 , 这不仅仅简化了分子识别 , 也为估计分子扩散系数提供了更多的机会 , 只要某化 合物能够产生一

11、个可分辨的交叉峰 , 就有可能分析其分子结构并估计扩散系数 。将扩散 NMR 用于药物筛选即为 “ 亲和磁共振” 27。 亲和磁共振实验条件 (即 :梯度强度 、 持续时间和延迟 的设定非常重要 , 所设条件在无受体存在时混合物各成分无信号出现 , 该条件下加入受体 , 无结 合作用的化合物在亲和磁共振实验中将不出峰 。 由于与受体结合的配体扩散速率明显降低 , 因而它们 的信号将出现在亲和磁共振谱图上 。 第一个亲和磁共振的研究实例是关于氢化奎宁 292菲基醚 (hydroquinine 292phenanthryl ether 受体与 8个可能配体混合物的相互作用 28。 在正常氢谱中 ,

12、9种化合物的信号都存在 , 当配体与受体结合时 , 其运动明显变慢 。 在亲和磁共振实验中采用扩散滤波的方法滤除快扩散成分 , 只有两种慢运动的与受 体结合的配体和受体本身出现在谱图上 , 其它所有配体的信号均消失 。在和亲和磁共振相同的条件下 进行 DECODES 实验 , 辨别出这两种化合物是 DL 2异柠檬酸内酯 (DL 2isocitric lactone 和 (S 2(+ 2O 2乙 酰基苯乙醇酸 (S 2(+ 2O 2acetylimandelic acid 。当混合物中有多个配体能与受体结合时 , 通过 DECODES 实验或调节受体 2配体相对浓度以匹配不 同配体结合能力的方法

13、 , 这些配体也可以一一得到识别 。 Lin 等 27报道了一个调节亲和磁共振实验条 件以匹配配体结合能力的实例 , 将氢化奎宁 292菲基醚加入 4种有机酸的混合物 , 根据其亲和能力 , 每一 3351第 11期 纪竹生等 :药物配体与生物大分子受体相互作用核磁共振的研究进展 种有机酸依次出现在亲和磁共振谱图上 。为了将亲和磁共振应用到更具有生理意义的体系中 ,Lin 等 29尝试了对 DNA 2药物相互作用的研究 。采用 DECODES 方法 , 在无结合作用的化合物腺嘌呤 (adenine 、 腺苷 (adenosine 和维生素 B1(thiamine 存在的情况下 , 他们识别出化

14、合物 Hoechst 33342与 Drew 2Dickerson dodecamer d (CGCG AA TTCGCG 2的相互作用 。 DECODES 方法研究 DNA 片断的优点 是 DNA 谱在芳香区域没有交叉峰 , 这就大大方便了有芳环的配体信号的识别和解析 。他们还研究了 糖肽万古霉素 (glycopeptide vancomycin 与 10种低聚肽混合物的相互作用 30。亲和磁共振研究表明 , 两种含 D 2残基的低聚肽 DDFA 和 DDFS 与万古霉素有明显的结合作用 。扩散编辑谱中始终存在受体信号 , 这可能是亲和磁共振的一个问题 。配体信号可能与受体信号重 叠 , 特

15、别是当受体为一分子量很大的蛋白质的时候 。对于小分子受体 DECODES具 , 但该方法很难适用于蛋白受体 。 , 同位素滤波 亲和磁共振得到了发展 31。 该实验以 13C , 序列外还使用 13C 滤波步 骤 。Hajduk 等 32, 该方法依赖于在低梯度和高梯度强度 , 差谱中仅仅显示结合配体信号 。 同位素滤波 PF G 实 20kDa 的基质酶催化域 (stromelysin catalytic domain 的研究 。 从以上的讨论中可知 , 根据扩散系数的相对大小 , 可以对分子进行谱编辑 , 使结合配体从它与非结 合分子的混合物中识别出来 。 但是 , 研究表明 , 化学交换

16、对扩散 NMR 实验中观察到的信号强度有非常 大的影响 , 弱结合配体” 结合态” 和” 游离态” 的化学交换能够引起严重的信号扭曲 , 从而造成灵敏度损失 和解析错误 。 由于能够识别弱结合配体是亲和磁共振的一大优势 , 因此这一影响无疑极大地限制了亲 和磁共振的应用 。 例如 , 使用 L ED 脉冲序列 , 在含有万古霉素和 DDFA 的样品中可观察到 DDFA 信号 的强度调制 33。 而使用 BPP 2L ED 脉冲序列 , 得到的则是没有这种余弦调制的信号 , 从而解决了这种由 于交换而产生的问题 。 因此 , 在扩散实验中 , 双极性 L ED 脉冲序列是一种更好的选择 , 由此

17、序列产生的 谱图没有化学交换调制或其他不良影响 。3 NOE 抽运 (NOE pumping除了交换调制外 , 亲和磁共振实验还存在其它问题 。 由于结合配体通常在游离态和结合态之间进 行交换 , 扩散系数的观测值 (D obs 是游离态 (D free 和结合态 (D bound 扩散系数的权重平均值 :D obs =x free D free +x bound D bound式中 x free 和 x bound 分别是游离态和结合态配体的摩尔分数 , x free +x bound =1。当小配体与大分子结合 时 , D free 可能比 D bound 大 1到 2个数量级 。 显然

18、, 游离配体对于权重平均的贡献将比结合配体要大得多 , 扩散系数的观测值将更接近于 D free , 也就是说化学交换模糊了结合配体和非结合配体之间的界限 , 其 结果是 , 结合配体和非结合配体扩散系数差别太小 , 以至难以区别 。亲和磁共振的另一个问题来自谱线的加宽 , 通过改变配体和受体的相对浓度 (即 :x free 和 x bound 使 结合配体扩散系数的观测值接近 D bound 是完全可能的 。在此情况下 , 结合配体和非结合配体在扩散速 率上的差别也足够大 , 但此时亲和磁共振谱上出现的主要是结合态的配体信号 。当小分子与大分子结 合时 , 结合态小分子的谱线常常太宽而无法直

19、接观测到 。 Shapiro 等 34研究了人血清白蛋白 (human serum albumin , HSA 、 水杨酸 (salicylic acid 、 葡萄糖 (glucose 及维生素 C (ascorbic acid 混合物的亲和 磁共振谱 , 其中 HSA 是受体 , 水杨酸是结合配体 , 葡萄糖和维生素 C 为非结合配体 。 3种配体的表观扩 散系数差别不大 , 虽然水杨酸与 HSA 结合后其扩散系数变小 , 但由于化学交换的平均作用变化并不明 显 , 在亲和磁共振实验中应用强梯度场压制非结合配体信号的同时 , 结合配体的信号也完全消失 。 结合 和非结合化合物的主要差别是结合

20、配体与受体紧密接触 , 这种空间距离上的接近无疑可以为分离提供 条件 ,NOE 能够提供自旋核跨空间相互作用的信息 , 这是其它技术很难做到的 。因此 ,NOE 是一种非 常重要的 NMR 方法 , 已成为研究分子结构的一种不可或缺的工具 。为了区别结合配体和非结合配体 ,Shapiro 等 34提出了 NOE 抽运方法 。首先使用扩散滤波以得到4351 分 析 化 学 第 32卷一种仅仅蛋白信号能够被检测到的状态 , 然后 , 应用 NOE 实验使信号从蛋白重新分配到结合配体 。抽运机理可以直观地用以下过程进行描述 :当 NOE 实验开始时 , 所有的配体信号都被破坏了 , 而 蛋白信号得以

21、保留 。 当蛋白质与配体发生相互作用时 , 如果他们作用的时间足够长且空间距离足够近 , 则在混合期 t m 发生磁化转移 。 这一分子间 NOE 的后果是 , 观测磁化由蛋白质转移给了结合配体 , 且 蛋白信号极大地被衰减了 , 因此 , 只有能够与蛋白结合的配体能够被检测到 。 当配体从蛋白中离解出来 时 , 转移过来的磁化由于游离态配体的弛豫时间较长而得以保持 。 即使结合配体由于谱线太宽而无法 直接观测 , 结合配体信号 (游离态和结合态的平均 仍然能够被检测到 。HSA 、 水杨酸、 葡萄糖和维生素 C 混合物的扩散滤波 NOE 抽运实验表明 , 当混合时间 t m 很小时 , 一维

22、 NMR 谱中仅含蛋白信号。 但随着 t m 的增加 , , 同时伴随蛋 白信号的减小 , 显然 ,HSA 然而 素 C 的信号始终没有出现。 因此 , 使用 NOE 抽运实验 , NOE NMR 筛选方法相比 , 该 方法具有以下优势 :, 而用于传统 NMR , 将参数变 , 如温度或 pH 等做图 , 结果常常不同。 由于检测的是配体信号 , 因此该 方法适用于化学位移难以分辨且未进行同位素标记的大蛋白质。 事实上 , 大蛋白质受体对该方法的使用 有利 , 因为在慢运动限制以内极化转移速率直接正比于相关时间 (或分子大小 , 所以受体的分子量越大 , 该技术的灵敏度越高。 另外 , 宽的

23、大分子信号屏蔽结合配体信号的可能性也较小。 该方法还适用于研究 弱的结合配体如溶剂 , 而且 , 把这一 NOE 实验向多维谱延伸可得到更详细的结合中心信息。NOE 抽运实验的缺陷在于 :为了检测从受体抽运到结合配体的信号 , 首先必须得到一种所有配体 信号均被压制仅仅能够检测到蛋白信号的状态 , 由于大分子通常具有很快的弛豫速率 (特别是 T 2弛 豫 , 因此在预备这种状态的同时 , 大分子信号将受到很大程度的损失 , 从而影响实验的灵敏度 。 为了提 高实验灵敏度和减少实验时间 ,Shapiro 等 35又提出了反向 NOE 抽运 (reverse NOE pumping ,RNP 方

24、法 。 与前述 NOE 抽运实验不同 ,RNP 技术用于检测从结合配体转移给受体的信号 。在 RNP 实验中 , 首先采用弛豫滤波 (或同位素滤波 压制受体信号 , 同时保持配体信号 , 然后通过 NOE 实验 (混合时间 t m 使信号从配体转移给受体 。 配体信号强度减小主要通过两种途径 , 其一为弛豫 (非结合配体 , 其二 为 NOE 抽运和弛豫 (结合配体 。 为了检测由于 NOE 抽运而造成的信号损失 , 需要记录一个由于弛豫 而造成信号损失的参考谱 , 该谱可以通过将相同的弛豫滤波放在 NOE 实验之后而获得 , 此参考谱只记 录弛豫造成的信号衰减而检测不到 NOE 抽运 。比较

25、上述两个实验所获得的图谱 , 就可以得到与受体 有结合作用的配体信息 。由于压制受体信号同时保留小分子配体信号相对来说比较容易 , 因此 ,RNP 谱具有较高的灵敏度 和较短的实验时间 。 同时 , 对蛋白和配体的浓度需求也大大降低 , 这就使研究体系更接近于生物环境 , 也使对溶解度较小的化合物的研究成为可能 。4 转移 NOE(transferred NOE另一种基于分子内转移 NOE 的 NMR 筛选方法是转移 NOE 36。 虽然 NOE 抽运和转移 NOE 筛选技 术都与 NOE 有关 , 但转移 NOE 的分离基础是转动速率 , 而不是分子间的空间距离。 转动速率很快的小分 子游离

26、配体通常显示正的分子内 NOE , 然而 , 如果配体与大分子量的受体相结合 , 它与具有很慢速率的受 体一起转动 , 从而显示很强的负 NOE 。 当游离态和结合态配体间存在化学交换 , 强的负 NOE 就会 “ 转移” 给游离配体 , 从而很容易被检测到。 因此 , 结合配体的分子内 NOE 信号将与小分子非结合配体的信号符 号相反。 二维转移 NOE 能够揭示受体加入后化合物分子内 NOE 信号的任何改变 , 因而提供了识别结合 配体和非结合配体的另一种方法 37。 与 NOE 抽运不同 , 转移 NOE 筛选技术不需要配体和受体间的分子 间 NOE 信息 , 该技术对受体的需求量很小。

27、 然而 , 由于 NOE 抽运是一种一维实验 , 所以它所花的时间较 少 , 同时 ,NOE 抽运能应用于大的配体 , 而大配体即使在游离态也可能给出负的分子内 NOE 。 5351第 11期 纪竹生等 :药物配体与生物大分子受体相互作用核磁共振的研究进展 5 药物 2蛋白质相互作用的动力学研究通过检测小分子配体在不同蛋白浓度时 NMR 弛豫速率或扩散系数的变化 , 可以进行药物 2蛋白相 互作用的动力学研究 。 Liu 等 3842以 HSA 作为模型蛋白 , 在这方面做出了大量有益的尝试并取得了 明显的进展 。作者应用 Langmuir 吸附等温方程结合 NMR 弛豫测量成功地推导出了药物

28、 /HSA 络合物的动力学 参数 (结合点的数目 , 络合常数等 43, 表明 Langmuir 吸附等温方程能够很好地解释蛋白与配体间的相 互作用 ; 利用药物分子与 HSA 结合前后 13C 2NMR 化学位移和线宽变化 , 从分子水平上研究了药物的结 合部位 ; 采用 NMR 化学位移 、 HSA 分子间相互作 用的影响 44, 结果表明 , 有机溶剂能够降低药物对 HSA , 作用 。 这些都为研究药物 2, 指导药物设计 提供了强有力的手段 。6 结 论, 亲和磁共振方法 、 NOE 抽运技术 、 转移 NOE 及有关药物 2蛋白 相互作用的动力学研究将极大地简化药物筛选过程 。 这

29、些技术的另一个优势是能够检测在高速筛选中 常常遗漏的低亲和力配体 , 并将其作为高亲和力配体的合成前体 。 NMR 方法的最大挑战是它的灵敏 度 。 与其他技术相比 ,NMR 方法在筛选混合物中的应用受到其相对不灵敏的限制 。考虑到溶解性 、 稳 定性和样品用量等因素 , 简单地增加混合物浓度通常是不明智的 。为使 NMR 方法能应用到更大和更 复杂混合物的筛选 , 有必要对 NMR 方法的硬件和软件系统做更大的改善 , 微量线圈和流动探头技术的 发展 , 将极大地提高 NMR 方法的灵敏度和筛选能力 。 混合物分析能力的提高还可以通过与其他技术 , 如 HPLC 、 MS 等联用而获得 。

30、作为一种多用途非破坏性的分析工具 ,NMR 将不断地得到完善 , 并为新 药物的发现做出更大的贡献 。R eferences1 Moore J M. Biopolymers , 1999, 51:2212432 Roberts G C K. Curr. Opin. Biotechnol , 1999, 10:42473 Moore J M. Curr. Opin. Biotechnol , 1999, 10:54584 Campbell I D , Dwek R A. Biological S pect roscopy , Menlo Park :Benjamin/Cummings , 198

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