高脂血症和动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者血浆蛋白质差异表达谱与脏腑功能的关系

1、    作者：宋剑南, 刘军莲, 房祥忠, 胡元会, 雷燕, 牛晓红, 吴刚, 陈保生, 马雅銮, 陈冰, 金红 【摘要】  目的：探讨高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候患者血浆特异性蛋白质群与脏腑功能之间的相关性。方法：采用中医证候诊断，观察146例高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候病人的脏腑功能状况。获取病人的血浆样品进行二维凝胶电泳，对差异表达蛋白进行二级质谱分析，寻找可区别不同痰瘀证候的特异性标志蛋白群。采用图模型分析方法研究不同痰瘀证候可能的标志蛋白与脏腑功能之间的相关性。结果：区分高脂血症及动脉粥样硬化病人中医痰证与痰瘀互

2、阻证可能的标志蛋白群中纤维蛋白原链、白蛋白及载脂蛋白AI前体主要与心气虚、肾气虚及脾气虚有关；区分痰证与血瘀证可能的4种标志蛋白质中，白蛋白和肾上腺髓质素结合蛋白前体与心气虚、肾气虚均有关，结合珠蛋白前体只与肾气虚有关，并通过肾上腺髓质素结合蛋白前体与心气虚相关，补体C4与之均无关；区分血瘀证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白群中白蛋白与心气虚、肾气虚及脾气虚均有关，而肾上腺髓质素结合蛋白前体只与脾气虚相关；区分非痰非瘀类与痰瘀类证候可能的标志蛋白纤维蛋白原链主要与肾气虚有关，载脂蛋白AI前体主要与肾气虚及心气虚有关。结论：高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候可能的血浆标志蛋白与不同的脏腑功能之间存在不

3、同的关联组合。 【关键词】  高脂血症; 动脉粥样硬化; 痰证; 血瘀; 血浆蛋白质类; 脏腑Objective: To investigate the relationship between the plasma biomarker proteins and the states of ZangFu organs in patients with phlegm or blood stagnation syndromes due to hyperlipidemia and atherosclerosis.Methods: The states of ZangFu orga

4、ns in 146 patients with perlipidemia and atherosclerosis were diagnosed by syndrome differentiation of traditional Chinese medicine. The plasma proteins from these patients were separated by twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE). Differential protein profiling was established by Im

5、age Master 6.0 software, and the differential proteins were analyzed by quadrupole time of flight mass spectrometry (QTOFMS). The association between the plasma biomarker proteins and the states of ZangFu organs was analyzed by graphical models.Results: The biomarker proteins such as fibrinogen gamm

6、a chain, albumin and apolipoprotein AI (precursor) in discrimination of the patients with phlegm syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome were correlated with the deficiency of kidneyqi, heartqi and spleenqi. Among the four biomarker proteins in discrimination of the patients with

7、phlegm syndrome from blood stagnation syndrome, albumin, adrenomedullin binding protein (precursor) and haptoglobin (precursor) were correlated with the deficiency of kidneyqi and heartqi, but complement component C4 was independent of the deficient ZangFu organs. The biomarker albumin was associate

8、d with the deficiency of kidneyqi, heartqi and spleenqi, and adrenomedullin binding protein (precursor) was correlated with the deficiency of spleenqi in discrimination of the patients with blood stagnation syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome. As the potential biomarker protei

9、ns in discrimination of the patients with nonphlegm and nonstagnation syndrome from phlegm accumulating with stagnation syndrome, the fibrinogen beta chain was related with the deficiency of kidneyqi, and apolipoprotein AI (precursor) was correlated with both the deficiency of kidneyqi and heartqi.C

10、onclusion: There exists inherent correlation between the states of ZangFu organs and the plasma probable biomarker proteins in the patients with different phlegm or blood stagnation syndromes due to hyperlipidemia and atherosclerosis.Keywords: hyperlipidemias; atherosclerosis; phlegm syndrome; blood

11、 stagnation; plasma proteins; ZangFu organs高脂血症属中医痰浊范畴。中医学认为，痰浊系人体脏腑气血失和，水谷津液运化失常所致。血脂和脂蛋白代谢紊乱是血中痰浊的重要生化物质基础1。研究显示，痰证患者有明显的血液流变学改变，主要表现为血浆流动性降低、聚集性增高和成分异常。同时，痰证患者血液流动性降低、聚集性增高导致了血液流变性质的改变，此种改变被认为是血瘀。痰瘀互结，胶着脉道，这便是中医学所认识的动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的主要病机。有临床研究指出，至少40以上的AS或冠心病患者属于痰瘀兼证2，这是我们将高脂血症及AS与中医痰瘀

12、证候结合起来研究的根据。本文旨在对已发现的不同痰瘀证候可能的标志蛋白群进行分析，研究其与脏腑功能的相互关系。1  资料与方法1.1  诊断标准  高脂血症的诊断按1997年中华心血管病杂志编辑委员会血脂异常防治对策专题组血脂异常防治建议标准3（甘油三酯2.3 mmol/L，总胆固醇6.2 mmol/L，符合其中一项即可诊断为高脂血症）；AS的诊断参照美国心脏病协会AS诊断及分类标准4。中医证候诊断参考国家技术监督局发布的中医临床诊疗术语国家标准GB/T1675.1219975。痰证：痰浊内阻，以咳嗽气喘、咯痰量多、呕恶眩晕或局部有圆滑

13、肿块、苔腻、脉弦滑等为常见症；血瘀证：瘀血内阻，血行不畅，以局部出现青紫肿块、疼痛拒按，或腹内癥块、刺痛不移、拒按，或出血紫暗成块、舌紫或有斑点、脉弦涩等为常见症；痰瘀互（搏）结证：痰浊瘀血相互搏结，以局部肿块刺痛，或肢体麻木、痿废、胸闷痰多或痰中带紫暗血块、舌紫暗或有斑点、苔腻、脉弦涩等为常见症；气虚证：元气不足，脏腑机能衰退，以气短乏力、神疲懒言、自汗、舌淡、脉虚等为常见症；心气虚证：心气虚弱，运血无力，以心悸气短、精神疲倦、舌淡紫、脉弱等为常见症；脾气虚证：脾气虚弱，以神疲、头晕、健忘、食少、腹胀、便溏、舌淡、脉弱等为常见症；肾气虚证：肾气虚弱，以腰膝酸软、夜尿多、小便不尽、舌淡、脉弱等

14、为常见症；肝气虚证：肝失疏泄，以两胁胀闷、情绪低沉、疲乏气短、头晕眼花、舌淡、脉弱等为常见症。1.2  纳入标准  （1）符合高脂血症和（或）AS疾病诊断标准；（2）符合中医证候诊断标准中血瘀证和（或）痰证的诊断。1.3  排除标准  （1）不符合痰证、血瘀证诊断标准者；（2）不属于脾、肾、心气虚和肝气虚（滞）。（3）肾病综合征、肝胆疾病及糖尿病、内分泌功能紊乱和造血系统疾病患者。（4）半年内患急性心肌梗死、脑血管意外、严重创伤或大手术者。（5）近1个月内服过调脂、活血、抗AS药物或因其他疾病正在服药者。（6）哺乳

15、、妊娠期妇女。（7）由药物引起的高脂血症。1.4  一般资料  2004年5月2005年8月，从中国中医科学院广安门医院和西苑医院心内科收集符合上述纳入标准的常住北京地区3555岁的汉族患者共146例，其中，男61例，女85例。证候分类为痰证32例，血瘀证38例，痰瘀互阻证41例，非痰非瘀类证35例。1.5  实验方法  采用美国BD公司真空采血器，空腹清晨采血4.0 ml，30 min内分离血浆，80 冰箱保存。用美国GE公司的Ettan IPGphor聚焦系统进行第一向等电聚焦。取20 l血浆样品与300 l重

16、胀液混合，与pH 310和18 cm的非线性胶条重胀聚焦。等电聚焦步骤：12 h重泡胀，24 h梯度升压至8 000 V，聚焦95 500 vhs。等电聚焦结束后，胶条在含1 2巯基苏糖醇和2.5碘乙酰胺10 ml平衡液中进行二步平衡。平衡好的IPG胶条转入预制的15聚丙烯酰胺凝胶板上部，进行第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDSPAGE）。分析胶采用考马斯亮蓝染色（按Neuhoff胶体考马斯亮蓝G250的方法进行）。染色后的胶用美国UMax公司Labscan凝胶图像扫

17、描仪扫描，然后用Image Master 6.0图像分析软件对血浆双向电泳图谱进行差异分析，比较蛋白斑点的数量及蛋白表达量，获取不同证候的差异蛋白质表达谱和区别不同痰瘀证候的可能的标志蛋白群，经二级质谱对这些标志蛋白质进行分析和数据库检索，确定蛋白质性质（另文发表）。1.6  统计学方法  采用图模型分析方法分析区分不同痰瘀证候可能的标志蛋白与脏腑功能的相互关系。图模型是一种用图来表示模型的多元统计分析方法，通过图中各个结点以及它们之间的边来表示变量之间的相互关系。它可以综合地考虑所有变量，得出多个变量之间的相互关系，能更准确地把变量之间深层次的关系表达

18、出来，从而优于以往的统计分析方法。图模型包括离散变量模型、连续变量模型和既有离散变量又有连续变量的混合模型3种。在图模型中，每一张图都是由结点和它们之间的边所组成。每一个结点代表一个变量，每两个结点之间是否有边代表了它们是否具有明显相关性。2  结果2.1  不同痰瘀证候患者血浆的蛋白质组学  前已发现区分痰证与痰瘀互阻证可能的标志蛋白主要有纤维蛋白原链、白蛋白和载脂蛋白AI前体；区分血瘀证与痰证可能的标志蛋白主要有结合珠蛋白前体、肾上腺髓质素结合蛋白前体、补体C4和白蛋白；区分痰瘀互阻证与血瘀证可能的标志蛋白主要有白蛋白和肾上腺髓质素结合蛋白前体；区分非痰非瘀类证候与痰瘀类证候可能的标志蛋白主要有载脂蛋白AI前体和纤维蛋白原链（详细研究结果将另文发表）。2.2  不同痰瘀证候患者的脏腑功能分布  对纳入的146例高脂血症及动脉粥样硬化不同痰瘀证候病例进行分析，发现同一证候可以兼有一种或多种脏腑的功能衰退