已经被证实可调控IFN-g

1、Abstract由於 T-bet 已經被證實可與調控IFN-g 的啟動子結合，因此被認為會與pIFN-g結合(3)，初期實驗是想利用轉錄因子：T-bet和IFN-g 啟動子的作用來探討 Yeast one hybrid 的系統是否可以偵測到兩者的作用。若可行，我們將利用此系統進一步來篩選其他能夠和IFN-g 啟動子作用的基因，與研究這些基因的產物是否可以促進T細胞從 Th 0 細胞分化到 Th1 細胞。Introduction 圖一：T 細胞分化的流程圖。T細胞的分化與人體免疫有密不可分關係。 人體的免疫反應可分為細胞調節的免疫反應（Cellular immunity）及體液調節的免疫反應（H

2、umoral immunity），T在這兩種調節系統中T細胞扮演細胞是人類免疫反應的重要的角色。重要樞紐，可分為以細胞當作媒介或是以抗體當作媒介兩種，他們T細胞在胸腺發育後經過正選及負選（Positive and negative selection）而成熟，之後然後這些成熟的 T細胞會從胸腺轉移到周圍的組織。在接受抗元原(Antigen)的刺激後，原始的輔助性 T 細胞 （Native CD4+ T helper cells；Th0）會因不同的細胞激素（Cytokine）刺激而分化成不同的輔助性T細胞（例如Th1 和 Th2），Th1細胞會分泌第二型干擾素（IFN-g），白介素2號（IL-2

3、），淋巴毒素（LT）和癌細胞死亡因子（TNF-a 和 TNF-b）。這些細胞激素可調控B細胞及其他類型的免疫細胞，然而，在極不正常的情況之下，這些細胞也可能造成自體免疫的疾病（例如：類風濕性關節炎、結腸炎、糖尿病和實驗性急性腦炎）和發炎的免疫反應。Th2 細胞則會分泌其它白介素4、5、10和13，這些細胞是涉及抗體的產生以及抗發炎反應，失調時會引起過敏(1)。（參見圖一） T細胞由從未受刺激的Th0細胞發展到 Th1細胞的分化過程中，第二型干擾素啟動子（Interferon gamma promoter；pIFN-g ）會被活化而導致IFN-g 的產生。一些例子顯示調控T細胞分化的分子也同時具

4、有調控細胞激素的表現。例如：T-bet 可以促進 T細胞從 Th0 細胞分化到 Th1 細胞，也可以控制 IFN-g 的表現。T-bet（Tbx21，Tbt1或TBLym）是由530個氨基酸所組成的轉錄因子，它具有T-box DNA結合區（T-box DNA binding domain）可與基因啟動子上的T-box序列（consensus T-box site; aatttcacacctaggtgtgaaatt）結合(2-4)。為了找出可使 T細胞由 Th0發展到 Th1 的分子，因此我們實驗室想要利用Yeast one hybrid 的系統(5)來找尋能與IFN-g promoter 序列

5、結合的蛋白質。Yeast one hybrid 系統的原理如圖二：圖二：Yeast one hybrid 系統的示意圖。此系統是將特別的 DNA 片段放在報導基因（Reporter gene）之前，再將這個構築的載體嵌入酵母菌的染色體中，然後帶有這個片段的酵母菌可被含有此段特別基因的DNA結合區（Binding domain; BD）及活化區（Activation domain; AD）之質體所表達的融合蛋白結合，最後我們可藉由實驗觀察報導基因的表現與否，來篩選會與這段特別DNA片段作用的基因。Materials and Methods(1) 構築含有第二型干擾素啟動子的質體（pIFN-g/p

6、LacZ）：（圖三） 設計合適的Primers，利用PCR技術來釣出Genomic DNA 內的第二型干擾素啟動子。pIFN-g 5primer：5gga ctt cct cac caa att gtt c3pIFN-g 3primer：5cct tta gac tcc ttg ggt cct t3 將IFN-g promoter 嵌入pLacZi載體（或pHISi、pHISi-1） 或 pLacZi 載體之中。選擇適當的限制酵素將載體直線化後，再利用接合酵素將PCR產物連接起來，然後根據pLacZi載體上帶有的Ampicillin抗生素篩選指標來作篩選。圖三：pIFN-g/pLacZ質體的構

7、築。首先利用PCR技術將IFN-g promoter序列由genomic DNA釣出，然後將此序列選殖入直線化的載體pLacZi中，然後利用載體抗藥性基因（Ampicillin）來篩選正確的菌株。(2) 將帶有報導基因和IFN-g promoter的核酸序列嵌入酵母菌的染色體：（圖四） 將pIFN-g/pLacZ質體直線化（Linearization）：用適當的限制酵素（Restriction enzyme）將質體直線化。pLacZi : Nco I 或 Apa I 轉形作用（Transformation）：利用轉形作用將直線化的pIFN-g/pLacZ核酸序列嵌入酵母菌YM4271染色體中，

8、並將之培養在適當的酵母菌篩選培養基上。pLacZi : SD/-Ura 培養基。 篩選帶有嵌入基因片段的酵母菌株：圖四：第二型干擾素啟動子的轉型及酵母菌的篩選。首先將pIFN-g/pLacZ 質體利用限制酵素直線化，然後將此直線化的質體利用轉型作用嵌入酵母菌YM4271中。其係利用相似性重組（Homologous recombination）的方式嵌入酵母菌的染色體中。因為pLacZi含有可製造Uracil 的基因，因此可利用缺少Uracil的培養基來做篩選。若是構築完成的載體沒有嵌入酵母菌的染色體之中，則酵母菌無法在此選擇性培養基中存活。根據酵母菌是否帶有嵌入報導基因的表現，然後在適當的篩選

9、培養基中生長。若有，則表示此酵母菌株帶有嵌入的報導基因;反之，則無。pLacZi 則是含有可製造 Ura 的基因，因此可利用缺少 Ura 的培養基來做篩選。(3) 構築含 T-bet 和 GAL4 AD 的載體（T-bet BD/GAL4 AD）（圖五）由於載體pGAD424上含有轉錄作用的活化區(Activation domain; AD)，而 T-bet 是已知的轉錄因子，因此將其DNA-binding domain(BD)與pGAD424 的AD 接合在一起，以產生帶有BD-AD的融合蛋白質以活化pIFN-g 下游的報導基因LacZ （b-galactosidase）。 設計合適的Pri

10、mers，利用RT-PCR技術將Genomic DNA 內的 T-bet 的DNA 結合區 (DNA-binding domain)核酸序列釣出。T-bet BD 5primer: 5aga gtc gcg ctc agc aac cac3T-bet BD 3primer: 5aaa gtt ctc ccg gaa tcc tt3 將含T-bet DNA-binding domain的核酸序列連接至 pGAD424載體中。 篩選帶有T-bet DNA-binding domain核酸序列的pGAD424菌株：圖五: T-bet BD/GAL4 AD 質體的構築。首先利用RT-PCR技術將T-b

11、et BD核酸序列釣出，接著利用接合酵素將其與直線化的pGAD424質體接合在一起，最後利用pGAD424質體上的抗藥性基因（Ampicillin）進行篩選。因為pGAD424載體本身帶有抗Ampicillin的基因，因此我們可在培養基內添加Ampicillin 來篩選正確的T-bet BD/GAL4 AD 菌株。(4) 測試 T-bet BD 和 IFN-g promoter 的作用：將構築好的T-bet BD/GAL4 AD質體轉型至帶有pIFN-g/pLacZ序列的酵母菌株(YM4271/pIFN-g/pLacZ)，以觀察T-bet BD/GAL4 AD所表現出的融合蛋白是否可活化YM4

12、271/pIFN-g/pLacZ 的報導基因：LacZ 的產物 b-galactosidase的表現。因此，我們可利用帶有b-galactosidase受質: X-gal的培養基做為篩選的指標。若b-galactosidase被活化而表現，則其可將X-gal分產解而產生藍色的產物，因此我們可以選擇帶有藍色酵母菌株。Result and Discussion(1) 構築pIFN-g/LacZ及T-bet BD/GAL4 AD質體： pIFN-g/LacZ質體（7277bp）的構築：圖六：T-bet BD 和 IFN-g promoter 的作用示意圖。將構築好的T-bet BD/GAL4 AD

13、質體，利用轉型作用將其殖入酵母菌株（YM4271/pIFN-g/pLacZi）中，然後將其塗在選擇性培養基（SD/-Leu/-Ura）上培養，觀察是否有藍色的菌落出現。根據我們所設計IFN-g promoter 的引子，我們可以得到327 bp長的核酸序列，將所得到的PCR片段接到pLacZi載體（6900 bp）的MCS site（Mutlicloning site），然後利用載體本身所帶有的抗藥性基因（AmpR）來作篩選，最後挑選單一菌株進行小量DNA的純化，再利用限制酵素分析所獲得的質體是否正確。 T-bet BD/GAL4 AD質體（7173bp）的構築：利用我們所設計的T-bet D

14、NA-binding domain之引子，進行PCR可以得到573 bp長的核酸序列，將此片段接到pGAD424載體（6600 bp）中，然後將其轉型至大腸桿菌內，利用載體本身所帶有的抗藥性基因（AmpR）來作篩選，最後挑選單一菌株進行小量DNA的純化，再利用限制酵素分析挑選正確的菌株。(2) YM4271/pIFN-g/pLacZ菌株的製作： YM4271與pIFN-g/pLacZi的轉型（Transformation）：用Yeast one-hybrid系統來尋找會與特殊DNA序列作用的Cis-acting element，必需將此特殊的DNA序列插入酵母菌的染色體中，在此我們先將構築的p

15、IFN-g/pLacZ質體，利用限制酵素將其直線化，根據電泳的分析，我們可以在7227 bp看到Single band，如此即可確認此質體完全直線化，然後將直線化的pIFN-g/pLacZ轉型至YM4271酵母菌株內。 YM4271/pIFN-g/pLacZ的篩選： 我們所構築的pIFN-g/pLacZ質體帶有URA3報導基因，此基因在YM4271菌株內被突變而具有缺失。因此，若我們成功的將直線化的pIFN-g/pLacZ嵌入YM4271酵母菌株，則此基因可表現orotindine-5-phosophate decarboxylase來合成Urial，如此即可在未含Urial 的選擇培養基中生

16、長。反之，因YM4271菌株的URA3基因有缺陷，所以無法在未含Urial 的選擇培養基中生長。 (3)檢測 T-bet BD/GAL4 AD 與pIFN-g 序列的作用： 轉形作用(Transformation)：將構築好的T-bet BD/GAL4 AD質體，利用PEG/LiAc的方法轉型至YM4271/pIFN-g/pLacZ酵母菌株內，然後將其塗在選擇培養基（SD/-Leu/-Ura）上。 篩選（Screening）:因為T-bet BD/GAL4 AD質體本身帶有合成Leucine所需的LEU基因，又YM4271/pIFN-g/pLacZ 菌株帶有合成Uracil所需的URA3基因。

17、因此送入的T-bet BD/GAL4 AD質體因可表現T-bet BD/GAL AD 融合蛋，所以應該可與YM4271/pIFN-g/pLacZ 染色體的pIFN-g 核酸序列作用，進而活化下游的LacZ基因，因此可將培養基上的X-gal 分解成藍色的產物。Reference1.Abbas, A. K., Murphy, K. M., and Sher, A. (1996) Nature 383, 787-7932.Shier, P., Hofstra, C. L., Ma, X. J., Wu, Y., Ngo, K., and Fung-Leung, W. P. (2000) Immunogenetics 51, 771-7783.Szabo, S. J., Kim, S. T., Costa, G. L., Zhang, X., Fathman, C. G., and Glimche